内质网应激与氧化应激在百草枯致大鼠肺纤维化中的作用＊

彭礼波，董瑶瑶，张志坚

（重庆市巴南区人民医院重症医学科 401320）

研究表明，氧化应激、ATP耗竭及细胞内钙稳态失衡是百草枯（paraquat，PQ）中毒后脏器损伤的主要机制之一，也是常见的诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的因素［1-3］。适度的ERS有利于组织细胞恢复内环境稳态和维持细胞正常生理功能，但持续或过强的ERS则会导致组织细胞的损伤［4］。PQ 进入细胞后会引起强烈的氧化应激，因此认为PQ 可能通过氧化应激诱导ERS而在肺纤维化形成环节中发挥一定的作用。本研究旨在探讨ERS在PQ 中毒后肺纤维化形成中的作用，为PQ 中毒后肺纤维治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 20%百草枯溶液由上海先正达公司提供；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）及考马斯亮蓝试剂盒购于南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠多克隆葡萄糖调节蛋白质78（glucose regulating protein 78，GRP78）抗体、免疫组织化学SABC 试剂盒及DAB显色剂均购于武汉博士德公司。

1.2 百草枯诱导肺损伤模型的建立及动物分组 40只清洁级sprague-dawley（SD）大鼠，体质量（220±40）g，雌雄各半。将实验动物按随机数字表法分组。对照组（n＝8）：给予生理盐水1mL一次性灌胃；PQ 染毒组（n＝32）：将20%PQ 溶液按50mg／kg用生理盐水稀释，给予1mL一次性灌胃建立中毒模型，灌胃后按不同时间分为4个亚组，每组8只大鼠。染毒组分别于灌胃后1、7、14、21d腹腔注射戊巴比妥钠（30mg／kg）麻醉，腹主动脉放血处死，取肺组织进行相应处理后备用；对照组于21d作同样处理。

1.3 肺组织标本采集 按预定时间点处死动物。分离主支气管并向下剥离后取出全肺，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干。取右肺中叶10%中性甲醛溶液固定48h后转移至0.1 mol／L PBS溶液中保存，待行肺组织病理学形态及免疫组织化学检测。左肺中叶取下后-80 ℃保存，待测SOD 及MDA。

1.4 肺组织GRP78蛋白免疫组织化学检测 常规切片脱蜡水化，3%H2O2处理，微波修复抗原，滴加兔抗大鼠GRP78多克隆抗体（浓度5%），4 ℃过夜后加生物素化羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，加SABC 工作液，DAB 显色，苏木素染色。阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。每个样本随机抽取5个视野高倍镜下观察，以细胞质黄染的细胞作为GRP78阳性表达的细胞，计算出阳性表达细胞占细胞总数的百分比。阳性细胞百分率＝（阳性细胞数／细胞总数）×100%。

1.5 肺组织MDA 水平及SOD 活性检测 肺组织MDA 水平及SOD 活性测定按试剂盒说明书采用比色法进行检测。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差法，两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺组织MDA 水平及SOD 活性变化 与对照组比较，染毒组MDA 水平随时间推移逐渐增加，各时间点均明显高于对照组（均P＜0.05）。而SOD 活性较对照组明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

2.2 肺组织GRP78蛋白免疫组织化学结果及半定量分析 与对照组比较，染毒组1d 肺组织GRP78 表达量明显增加（P＜0.01）。染毒后7d达高峰，14d明显下降，21d时与对照组无统计学差异（P＞0.05）。见表1、图1。

表1 不同时间点大鼠肺组织内MDA、SOD 及GRP78 蛋白表达变化比较（±s，n＝8）

表1 不同时间点大鼠肺组织内MDA、SOD 及GRP78 蛋白表达变化比较（±s，n＝8）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与对照组比较。

组别 MDA（nmol／mg） SOD（U／mg）GRP78对照组0.81±0.04 95.52±10.12 3.18±1.02染毒组1d 1.51±0.12a 78.14±9.52a 14.25±6.36b染毒组7d 2.03±0.19b 65.22±7.28b 12.78±6.01b染毒组14d 2.99±0.22b 41.85±5.11b 6.85±4.23a染毒组21d 3.81±0.28b 30.81±3.02b 4.46±0.99

图1 两组大鼠肺组织GRP78表达情况（免疫组织化学×400）

2.3 肺组织形态学变色 HE 染色光镜下对照组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡间隔正常，肺泡腔内无炎性细胞浸润。染毒组21d肺组织内出现炎性细胞浸润，肺泡壁断裂，严重时出现弥漫性肺出血。见图2A、B。Masson染色见对照组肺泡结构正常，染毒组21d可见蓝染的胶原纤维，随时间延长，蓝染胶原纤维逐渐增多。见图2C、D。

图2 肺组织病理切片（×200）

3 讨 论

大量基础研究表明氧化应激是肺纤维化的重要发病机制之一，特别在PQ 中毒中该机制占有更加重要的作用，因此减轻PQ 中毒后氧化应激、纠正机体氧化-抗氧化失衡可明显减轻肺纤维化程度［5-8］。SOD 是机体内最主要的氧自由基清除酶，测定其活力可反应机体自由基清除能力；MDA 则是脂质过氧化产物，测定其含量可反映机体组织细胞氧化损伤的程度，对上述指标的联合检测能评价组织细胞的氧化应激水平。本研究中发现，染毒组大鼠肺组织MDA 较对照组明显升高，而SOD 则明显降低，病理切片提示肺组织受损程度随时间推移逐渐加重，说明氧化应激在PQ 中毒肺损伤中占重要地位。

内质网是哺乳动物细胞重要的Ca2＋贮存器，也是蛋白质合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠与装配、参与脂质代谢和类固醇激素合成的重要场所。研究发现，多种因素可导致内质网稳态破坏。而内质网能通过减少蛋白质翻译、分子伴侣以及相关蛋白表达上调，增加未折叠蛋白质降解等途径力图使内质网恢复稳态，这些变化统称ERS［9-10］。GRP78 是广泛分布于内质网的分子伴侣，其主要功能是协助蛋白质的折叠、装配及运输。当应激因素导致ERS 发生后，GRP78 合成显著增加，因此又称其为ERS发生的标志性蛋白［11］。越来越多的研究表明ERS参与了很多中毒相关性疾病的发生发展，如有机磷农药、重金属、乙醇及某些药物等［12-15］。近年研究表明氧化应激是ERS的重要诱因，ROS是触发ERS介导凋亡通路的上游因子。本研究结果表明染毒组大鼠肺组织中ERS标志性蛋白GRP78表达显著增加，随时间延长而逐渐增加。结果表明PQ中毒导致肺纤维化中除了氧化应激作用外，还有ERS参与，其机制可能是PQ 进入细胞后激活ROS级联反应，机体释放大量ROS，从而诱发ERS发生。但其具体机制尚需进一步研究。

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