疏肝消脂Ⅲ方胶囊对NAFLD模型大鼠脂联素及胰岛素抵抗指数干预作用研究

聂钊源 冯崇廉 邓 炜 陈 进

(广州医科大学附属第三医院中医科, 广东 广州 510150)



·临床研究·

疏肝消脂Ⅲ方胶囊对NAFLD模型大鼠脂联素及胰岛素抵抗指数干预作用研究

聂钊源 冯崇廉*邓 炜 陈 进

(广州医科大学附属第三医院中医科, 广东 广州 510150)

目的:探讨疏肝消脂Ⅲ方胶囊对大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型脂联素(ADP)及胰岛素抵抗评估指数(HOMA-IRI)的干预作用。方法：采用高脂乳剂灌胃法建立NAFLD大鼠模型，造模成功后，给予疏肝消脂Ⅲ方胶囊灌胃干预4周，观察大鼠一般情况及肝组织病理形态变化；检测血清血糖(FBG)、胰岛素(FINS)含量，计算稳态模型HOMA-IRI；采用ELISA法检测肝组织匀浆ADP的含量。结果：药物组FBG、FINS、HOMA-IRI水平较模型组显著降低(P<0.05)，肝组织ADP含量较模型组增高(P<0.05)，减轻病理学损伤。结论：疏肝消脂Ⅲ方胶囊治疗NAFLD的机制与提高肝组织ADP表达，改善胰岛素抵抗，减轻肝细胞脂肪变性及炎症浸润有关。

疏肝消脂Ⅲ方胶囊；非酒精性脂肪肝；脂联素；胰岛素抵抗

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝脏脂肪储积和脂肪变性为主要病理特征的病理综合征。疾病后期可进展为肝硬化、肝癌，而肝硬化不可逆转，严重影响患者的健康及生活质量[1]。近年来，中医药在脂肪肝的防治研究日趋活跃，并显示出良好的发展前景，对减缓慢性肝病的进展及改善预后有积极的意义。

在NAFLD的发病过程中，常伴有一系列细胞因子表达的变化，如脂联素(adiponectin, ADP)、瘦素(leption , LEP)等，参与NAFLD的发生发展过程，介导糖脂代谢、氧化应激、炎症反应和免疫功能等[2]。疏肝消脂Ⅲ方胶囊是冯崇廉教授从中医“肝主疏泄”理论组方用药，经验和科学研究结合研制而成，具有疏肝理气、祛瘀化痰的功效，在临床应用和科学研究中显示出良好的效果及应用前景。本研究拟观察疏肝消脂Ⅲ方胶囊干预NAFLD大鼠血清空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、稳态模型胰岛素抵抗评价 (HOMA-IR) 指数、肝组织脂联素(ADP)和病理学的变化，探讨其治疗脂肪肝的作用机制，为该药的临床应用推广提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级近交系健康雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠46只，体质量180～220g，购于广东省医学实验动物中心。实验动物质量合格证明：44007200016915。

1.2 实验药物、试剂、仪器

疏肝消脂Ⅲ方胶囊，由牛黄田七散合四逆散组方加减而成，每粒胶囊含原生药量约3.12 g，由广州医科大学第三附属医院中医科委托广东新峰药业协制。葡萄糖检测试剂盒，购于罗氏诊断产品(上海)有限公司；胰岛素(INS)试剂盒，购于南京建成生物工程研究所)；脂联素(ADP)试剂盒购于cloud-clone公司；多聚甲醛、二甲苯购于广州化学试剂厂；Rt2100c酶标检测仪，购于Rayto公司等。

1.3 造模材料

高脂乳剂配制，参考文献[3-4]配方加以改进：200 mL猪油、100 g胆固醇、10 g丙硫氧嘧啶、10 g蛋黄粉、20 g胆酸钠、200 mL吐温-80、200 mL丙二醇、300 g果糖、蒸馏水等；分装置于4 ℃冰箱保存，使用时用37 ℃水浴，解冻后灌胃。

1.4 给药方法

分组后给予药物干预，每日固定时间灌胃予疏肝消脂Ⅲ方胶囊溶液。用量按照动物与人体的每公斤体重剂量折算系数换算，分别折算成大鼠剂量为疏肝消脂Ⅲ方胶囊(315 mg/kg)，以蒸馏水稀释成对应浓度的溶液灌胃使用。模型组及正常对照组则予以相同容积的蒸馏水。

1.5 造模与分组

[3-5]制模方法，采用高脂乳剂灌胃法建立大鼠NAFLD模型；动物检疫合格后，大鼠随机分为正常对照组10只，NAFLD模型组24只。每天上午正常对照组按1 mL/100 g体重灌服蒸馏水，模型组按1mL/100 g体重灌服高脂乳剂。灌胃2周后，眼眶静脉丛采血约测定总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，与正常对照组比较，形成高脂血症后，模型组随机选取4只大鼠进行病理切片观察，病理结果显示大部分肝细胞肿胀，形态排列不规则，胞浆内充满大小不等的脂滴。模型组余下20只大鼠随机分成2组，即NAFLD模型组、疏肝消脂Ⅲ方胶囊(315 mg/kg)组，加上正常对照组，一共3组，每组10只。每天上午，除正常对照组给予等量蒸馏水灌胃外，其余各组灌胃高脂乳剂；每天下午，正常对照组和NAFLD模型组则给予等量蒸馏水，疏肝消脂Ⅲ方胶囊组给予对应药物灌胃。

药物治疗4周后，术前禁食，以3%的戊巴比妥钠腹腔内麻醉，经腹主动脉采血5 mL，分离出血清，置冻存管保存于-20 ℃的冰箱内，待用；取血完毕后，所有动物放血处死，迅速解剖摘取肝脏，用4 ℃预冷的生理盐水冲洗其表面血液，滤纸拭干，取约2 g左右肝组织至-80 ℃冰箱保存备用；每只大鼠切取肝右叶的一半放于10%的中性甲醛溶液中固定，病理检测备用。

1.6 检测指标

1.6.1 一般情况观察 观察动物的日常情况包括体形、皮毛、皮肤、粪便、肌肉张力、步态、精神、呼吸等。

1.6.2 FBG、FINS检测 血清FBG检测采用己酶激酶法，按照试剂盒操作说明处理血清样品，由德国罗氏C8000全自动生化仪测定；血清FINS检测按照试剂盒操作说明采用ELISA法。

1.6.3 根据公式计算稳态模型胰岛素抵抗评估指数 HOMA-IRI=FINS×FBG/22.5。

1.6.4 肝组织ADP检测 制备肝组织匀浆，按照试剂盒操作说明采用ELISA法检测肝组织ADP含量。

1.6.5 肝组织病理学观察 将固定于甲醛溶液中的各组大鼠肝组织依次经脱水、透明和石蜡包埋后，连续切片，切片厚度约4 μm，进行HE染色。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠的一般情况

实验至第6周结束，饲养期间，各组大鼠全部存活。正常组大鼠精神状态良好，动作灵活，反应敏捷，皮毛光泽整洁，体重稳定上升，食量正常，大小便正常；模型组大鼠随着造模时间的延长，精神萎靡，动作反应迟缓，行动欠佳，皮毛蓬松，欠缺光泽，体重略有减轻，饮食减少，大小便正常。药物组大鼠精神状态较好，动作尚灵活，反应较灵敏，皮毛色泽较模型组好，食欲均有减少，体重略有减轻，大小便正常。模型组与药物组大鼠体重、饮食情况的改变考虑可能与高脂乳剂引起胃肠道刺激有关。

2.2 疏肝消脂Ⅲ方胶囊对大鼠FBG、FINS、HOMA-IRI的影响

与正常组比较，模型组大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IRI水平显著性升高(P<0.05)。而给予药物干预后，大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IRI水平不同程度降低，疏肝消脂Ⅲ方胶囊组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清FBG、FINS、HOMA-IR的比较结果

注：与正常组比较,*P<0.05； 与模型组比较,#P<0.05

2.3 疏肝消脂Ⅲ方胶囊对大鼠肝组织ADP的影响

与正常组比较，各组大鼠肝组织匀浆ADP水平均显著性降低(P<0.05)，其中模型组ADP水平最低。而给予药物治疗后，大鼠肝组织匀浆ADP水平不同程度提高，疏肝消脂Ⅲ方胶囊组与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝组织脂联素(ADP)含量的比较结果

注：与正常组比较,*P<0.05； 与模型组比较,#P<0.05

2.4 各组大鼠肝组织病理形态学变化的比较结果

病理学组织诊断标准参考文献[6]，各组大鼠肝脏病理结果显示：正常组的汇管区结构正常，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列，结构清楚，肝细胞为单核或双核，颗粒大小均匀一致；模型组肝脏病理呈中-重度脂肪变性，肝细胞肿胀，胞浆内见大量形状大小不等的脂滴(空泡)，较大的脂滴将细胞核挤向周边，肝小叶及汇管区可见炎症细胞浸润，以淋巴、单核细胞为主，肝索排列紊乱，结构不清晰(无呈放射状排列)。疏肝消脂Ⅲ方胶囊组以轻-中度脂肪变性为主，肝细胞肿胀减轻，胞浆内脂滴减少，细胞核大小较均匀。胞质可见少量炎症细胞，汇管区可见少量炎症细胞浸润，肝索排列较整齐，结构较清晰。与模型组相比较，说明疏肝消脂Ⅲ方胶囊能减轻肝脏脂肪变性程度，减轻细胞炎症，但与正常组比较仍有差异，未能达到正常组水平。见图1。

注：A. 正常组；B. NAFLD模型组；C. 疏肝消脂Ⅲ方胶囊组

图1 各组大鼠肝组织病理学形态变化比较结果(HE, ×400)

3 讨 论

迄今为止，对NAFLD的发病机制尚未完全阐明，目前较为成熟及完善的理论为Day等[7]提出的“二次打击”学说为主，其学说强调了胰岛素抵抗、氧化应激、细胞因子表达变化等在NAFLD发病中的作用。ADP是脂肪组织分泌的一种肽类激素，是目前已知的脂肪细胞因子中唯一的负性调节激素，其作为一种抵抗肝脂肪变性、炎症反应和肝纤维化的新型激素参与NAFLD的发病过程[8]。ADP能加快血浆中游离脂肪酸的清除，降低甘油三脂水平[9]。ADP水平下降可减少体内脂肪酸氧化反应，减少葡萄糖在骨骼肌细胞中的摄取，并增加肝细胞的糖异生，导致血糖水平升高；另一方面，可减少脂肪酸β氧化反应，导致FFA水平升高，肝脏脂质沉积，发生炎症及增加胰岛素抵抗，进而降低葡萄糖的吸收，导致血糖及脂质代谢异常。因此，ADP具有增强脂肪酸β氧化，改善胰岛素敏感性，减轻胰岛素抵抗水平，改善脂质代谢的作用，同时具有抑制炎症，减轻氧化应激而保护肝细胞等作用[10-11]。中医认为，胰岛素抵抗与肝脾气机失调，津液代谢异常，痰浊血瘀互结等因素有关，且痰瘀贯穿整个病程[12]。临床上辨证施药以疏肝解郁、健脾益气、化痰祛湿、活血祛瘀等法调整人体阴阳。

疏肝消脂Ⅲ方胶囊具有疏肝理气、祛瘀化痰的功效，以牛黄田七散合四逆散加减组方而成，方中牛黄、田七相须为伍，加强化痰祛瘀之功。方中柴胡、白芍、枳壳行气疏肝解郁；佛手、荷叶升清降浊，佐以疏肝；丹参、山楂、郁金等活血祛瘀；田基黄、川萆薢、泽泻等清肝利胆祛湿。诸药合伍共奏疏肝解郁、行气化痰、活血化瘀之功，药效平和，不易损伤人体正气。前期研究表明可改善大鼠肝功能、脂质代谢、炎症反应，减轻氧化应激及改善脂质过氧化等疗效[13-15]；毒理学研究表明疏肝消脂Ⅲ方胶囊规定剂量下服用安全可靠[16]。

本研究表明，疏肝消脂Ⅲ方胶囊组FBG、FINS、HOMA-IRI水平较模型组均降低(P<0.05)，肝组织ADP含量较模型组增高(P<0.05)，形态学上的肝细胞脂肪变性和炎症浸润得到改善和恢复，显示疏肝消脂Ⅲ方胶囊有保护肝脏的作用。基于中医药的多靶点效应，疏肝消脂Ⅲ方胶囊对NAFLD的干预作用靶点之一有可能通过调节肝组织ADP水平，从而改善胰岛素抵抗、减轻肝细胞炎症、减轻肝细胞脂肪变性等有关。肝损伤疾病的病理机制复杂，多种因素相互作用，互相转化，共同参与促进疾病的发生、发展及转归预后。中成药复方的优势所在是其具有多靶点调节作用[17]，如何通过机体调节肝脏脂肪细胞因子的表达水平，增强胰岛素与受体结合提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，降低脂质在肝脏的蓄积，减轻肝细胞的损伤，有望成为今后探讨的热点。

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(本文编辑:张辉)

Intervention of Shugan Xiaozhi Recipe III Capsules on adiponectin and insulin resistance index in NAFLD rat models

NieZhaoyuan,FengChonglian,DengWei,ChenJin

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China)

Objective:To investigate the intervention of Shugan Xiaozhi Recipe Ⅲ (SXR Ⅲ) Capsules on adiponectin (ADP) and insulin resistance (IR) index in rat models with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods:The NAFLD rat models were established by gavage of high-fat emulsion. After the rat models were established successfully, the rats were given SXR III Capsules by gavage for 4 weeks. The general condition and pathological changes of liver tissues in rats were observed. The fasting blood glucose (FBG) and fasting insulin (FINS) contents were determined. Homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IRI) was calculated. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the ADP content in the liver tissues.Results: Compared with the untreated model group, the levels of FBG, FINS, and HOMA-IRI were decreased (P<0.05), and the content of ADP in the liver tissue was increased (P<0.05) in the medication group, with milder pathological damage.Conclusion:The mechanism of SXR III Capsules in the treatment of NAFLD may be associated with increased expression level of ADP in the liver tissue, improved IR, and reduced hepatocyte steatosis and inflammatory cells infiltration.

Shugan Xiaozhi Recipe III Capsules; non-alcoholic fatty liver; adiponectin; insulin resistance

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.006

广州市“十二五”中医重点专科—肝病科(穗卫中[2013]6号)；广州市中医药科技项目(项目编号：2014A011005)

聂钊源(1988-)，男，硕士，住院医师。

R285.5

2095-9664(2015)05-0024-04

2014-07-03)

研究方向：中医肝病。

*通讯作者：e-mail:fengchonglian@126.com