蝎毒多肽B5对正常及辐射后大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

胡莉莉 樊灵杰 香咏欣 彭 享 孔天翰 董伟华

(广州医科大学病理生理学教研室，广东 广州 511436)



·论著·

蝎毒多肽B5对正常及辐射后大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

胡莉莉 樊灵杰 香咏欣 彭 享 孔天翰 董伟华*

(广州医科大学病理生理学教研室，广东 广州 511436)

目的:观察蝎毒多肽B5(SVPB5)对正常及辐射后的大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)生长的影响。方法：利用全骨髓细胞贴壁法分离纯化rBMSCs，体外扩增传代，取第3～5代细胞为实验对象。实验分为正常对照组(IR-control)、正常加药组(IR-SVPB5)、辐射对照组(IR+control)以及辐射加药组(IR+SVPB5)。分别进行细胞计数、衰老相关β半乳糖苷酶染色及集落形成单位计数。结果：SVPB5对正常及辐射rBMSCs均有促进增殖的作用，其中SVPB5处理3 d后，对正常rBMSCs开始便表现为明显的促增殖作用(P<0.05)，而对辐射rBMSCs则于第10、11天表现出明显的促增殖作用(P<0.05)。SVPB5作用于正常rBMSCs后，其衰老染色阳性细胞率明显低于正常对照组(P<0.05)，其集落数明显高于正常对照组(P<0.05)。结论：SVPB5能促进正常及辐射后rBMSCs增殖，增强rBMSCs的增殖潜能并缓解其衰老。

蝎毒增殖多肽；骨髓间充质干细胞；细胞增殖；细胞衰老

骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，也被称为骨髓基质细胞或间叶祖细胞，存在于骨髓的基质部分，在骨髓有核细胞总数中只占有一小部分(0.001%～0.01%)。目前研究证实，BMSCs具有支持造血、促进造血重建等作用[1]。在骨髓微环境中，BMSCs通过造血微环境与造血干细胞、细胞外基质、细胞因子、粘附分子等之间形成复杂的相互作用，从而实现对正常造血调控的精细调节，其结构和功能的完整性对于保持机体在生理状况下尤其是应激状态下造血的稳定性具有重要作用。

蝎毒多肽B5(scorpion venom peptide B5，SVPB5)是从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化的一种分子量为7 212.33 Da、含66个氨基酸残基的多肽[2]。前期的研究结果显示，SVPB5具有明显的促辐射后小鼠骨髓造血功能恢复的作用，且SVPB5对X射线辐射后大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，rBMSCs)有明显促增殖，缓解其衰老的作用[3]。然而，SVPB5对正常rBMSCs的作用仍不清楚。本研究以rBMSCs为实验对象，观察SVPB5对正常rBMSCs生长的影响，并连续观察SVPB5对X线辐射后的rBMSCs的促增殖作用。

1 材料与方法

SPF级SD大鼠，雌性或雄性，6～8周，180～220 g，购自广东省医学实验动物中心[动物质量合格证明No.4407209475，许可证号：SCXK(粤)2008-0002]。

1.2 主要试剂

SVPB5(本实验室分离纯化制备)，L-DMEM培养基粉剂(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，青霉素-链霉素双抗(Gibco)，L-谷氨酰胺(Sigma)，0.25%胰酶(Gibco)，碳酸氢钠(广州试剂)，衰老试剂盒(Cell Signaling Technology)，结晶紫粉末。

1.3 主要器械及仪器

眼科剪和眼科镊，2 mL无菌注射器，CO2培养箱(Thermo)，超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置相差显微镜(Nikon)，数码相机(Samsung)，离心机(Eppendorf，离心半径为6 cm)，X射线机(SIMENSE Primus)。

1.4 实验方法

1.4.1 全骨髓细胞贴壁法分离纯化rBMSCs 将SD大鼠颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡5 min，于无菌条件下取出其双侧股骨和胫骨置，去掉两端骨骺。用无菌的2 mL注射器以无血清L-DMEM充分冲洗骨髓腔三次，收集骨髓全细胞液，900 r/min离心5 min后去除上清，L-DMEM完全培养基(含10%胎牛血清、1%双抗、2 mmol/L L-谷氨酰胺)重悬细胞沉淀，每只SD大鼠的全骨髓细胞接种至1个75 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h后半量换液，48 h后全量换液，以后3 d换液1次。P0～P2细胞培养7～9 d至细胞布满瓶底约90%左右后胰酶消化2 min，以1∶2传代。P3以后的细胞培养3 d(细胞融合80%～90%)后即可以1∶2传代。收集P3～P5细胞进行相应的实验。

经过大量的实验表明，在螺栓连接较为紧密时，两传感器所采样的振动信号基本以振动激励的振动函数为主，此时两信号除振动幅度以外，基本不存在其他差异，也反映出两被联件连接相当紧密受激励部件完全跟随主振器件发生振动。然而，当螺栓连接不紧密，出现松动时，其振动波形包含高次谐波，而高次谐波在本系统中不作为判定条件，属于没有意义的引入杂波，需对其进行滤除。本文选用FPGA进行数字滤波，其主要特点是对不同的应用场合可通过改变FPGA内滤波器的方式来适应不同的应用场合，例如高频振动环境下的滤波并不适用于低频振动环境下的滤波情况，而不需要更换硬件设施，只需将FPGA的代码做更改即可适应不同工作环境[11]。

1.4.2 X线辐射细胞模型 收集P3～P5对数生长期细胞，以4×103/孔的密度接种于12孔板，培养12 h待细胞贴壁后，利用等中心照射技术(SAD)对细胞进行总剂量8.0 Gy的X射线照射，辐射后尽快进行细胞换液，并根据实验目的进行相应处理。

1.4.3 SVPB5对正常及辐射rBMSCs生长的影响 实验分为正常对照组(IR-control)、正常加药组(IR-SVPB5)、辐射对照组(IR+control)以及辐射加药组(IR+SVPB5)。正常组以1×103/孔的密度将rBMSCs接种于12孔板，贴壁12 h后进行换液并按照分组加药处理，3 d加药1次。于首次加药处理后每天进行细胞计数并计数至加药后第6天；辐射组以4×103/孔的密度接种rBMSCs于12孔板，贴壁12 h后进行辐射并换液加药，每3 d加药1次，计数首次加药后至第11天的细胞数。计数的同时在倒置相差显微镜下观察细胞形态及细胞密度。

1.4.4 衰老相关β半乳糖苷(senescence associated beta-galactosidase，SA-β-gal)活性检测 将rBMSCs以2.5×102/孔的密度接种于6孔板中，贴壁12 h后换液加药，3 d加药1次，于加药后第9天按照衰老试剂盒说明书步骤进行SA-β-gal染色，衰老细胞染色蓝色为阳性细胞，倒置相差显微镜下观察，计算每1 000个细胞中阳性细胞的百分率。

1.4.5 集落染色 将rBMSCs以1.25×102/孔的密度接种于6孔板中，贴壁12 h后换液加药，3 d加药1次，于加药后第7天对集落进行结晶紫染液(0.1%)染色，水洗，干燥，倒置相差显微镜下观察集落染色情况，肉眼计数每个孔内集落数量，以含50个以上细胞团为1个集落。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 rBMSCs生长特性

全骨髓细胞接种24 h半量换液后可观察到贴壁与悬浮的圆形细胞分界清楚，48 h全量换液可去除绝大多数的悬浮细胞，贴壁细胞开始呈现梭形及多边形变化，培养5 d后悬浮细胞通过全量换液全部去除，一部分梭形的贴壁细胞出现由3～5个形态相同的细胞成簇生长的小集落，至第7 d时长至旋涡状或呈一定方向生长的梭形干细胞大集落，可传代。第1代及第2代细胞虽大多数细胞形态为长梭形，折光性强，且大小均一平行排列呈旋涡状，但周围仍含有一些圆形细胞或短梭形基质细胞，第3代以后，细胞生长速度明显增快，已经纯化至形态均一，折光性强，长梭形的rBMSCs。见图1。

图1 不同代大鼠骨髓间充质干细胞的形态(倒置显微镜,×100)

2.2 SVPB5对正常及辐射后rBMSCs的促增殖作用

2.2.1 SVPB5对正常rBMSCs的促增殖作用 正常加药组细胞数均高于正常对照组，尤其从第3天开始，正常加药组细胞数明显高于正常对照组(P<0.05)，见图2A。提示SVPB5对正常rBMSCs有促增殖作用。2.2.2 SVPB5对辐射rBMSCs的促增殖作用 辐射加药组细胞数高于辐射对照组，尤其在辐射后10、11 d最为明显(P<0.05)，见图2B。提示SVPB5对辐射rBMSCs有促增殖作用，且其促增殖作用出现较晚。

2.3 SVPB5对正常rBMSCs衰老的作用

SA-β-gal是细胞衰老的生物学标志，通过对其进行染色可较为直接的观察到衰老细胞形态及数量。SA-β-gal染色阳性的细胞表现为围绕细胞核的周围细胞质蓝染，镜下观察正常加药组(图3B)蓝染细胞明显少于正常对照组(图3A)。正常对照组和正常加药组SA-β-gal染色阳性细胞百分率分别为(18.33±1.65)%和(10.7±0.7)%，两组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。提示SVPB5能下调rBMSCs细胞SA-β-gal的表达，抑制细胞衰老，延长细胞寿命。

注：A：正常rBMSCs；B：辐射rBMSC；与对照组比较,*P<0.05

图2 SVPB5对正常及辐射rBMSCs的促增殖作用

注：A：正常对照组(倒置显微镜,×100)；B：正常加药组(倒置显微镜)；C：SVPB5对正常rBMSCs衰老阳性细胞率的影响；与正常对照组比较，*P<0.05

图3 SVPB5对正常rBMSCs的衰老抑制作用(9 d)

2.4 SVPB5促进正常rBMSCs集落的形成

集落计数结果显示，正常加药组集落数量明显多于正常对照组(P<0.05)(图4)。提示SVPB5促进正常rBMSCs集落的形成。

注：与正常对照组比较，*P<0.05

图4 SVPB5对正常rBMSCs集落形成的作用(7 d)

3 讨 论

放化疗是肿瘤的常规治疗模式，然而这些治疗方法并不是肿瘤特异性的，极易造成正常组织的损伤，尤其是骨髓造血功能的抑制。有研究表明，辐射诱导的骨髓抑制主要是通过造血干细胞(hematopoiesis stem cells，HSCs)的细胞死亡引起，而骨髓抑制后骨髓重建主要依赖于两个因素：充足的造血干细胞及充足的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)[4]。本实验以rBMSCs为实验对象，用细胞计数的方法连续观察SVPB5对X线辐射后rBMSCs的作用，发现SVPB5能促进辐射后rBMSCs增殖，提示SVPB5可通过促进MSCs增殖而促进放疗后的骨髓重建。

随着细胞工程学和组织工程学的发展，利用MSCs的多向分化性及其可在体外表达多种外源目的基因的特性，将其作为种子细胞用于细胞治疗和基因治疗的研究已成为当前研究的热点[5]。而如何得到大量纯化的MSCs则成为临床利用这些细胞治疗疾病的前提。本实验结果显示，SVPB5促进rBMSCs增殖，同时还促进rBMSCs的集落形成，提示SVPB5不仅促进了rBMSCs的增殖速度，还增强了rBMSCs的增殖潜能，这无疑为大量体外扩增MSCs提供了新的方法。

本研究结果还显示，SVPB5对正常及辐射rBMSCs均具有促增殖的作用，但是前者的促增殖作用出现较早(加药后第3天)，而后者的促增殖作用则出现较晚，提示SVPB5对正常和辐射rBMSCs促增殖作用的机制可能不同。前期研究发现，SVPB5促进辐射rBMSCs增殖可能与促进了辐射后受损的MSCs的自我修复，维持了其干细胞的自我更新能力有关。刘铭超等[6]发现大黄素于加药后48 h开始促进rBMSCs增殖，可能与血小板生成素(TPO)基因及干细胞因子(Kitlg)基因表达明显升高有关。黄进等[7]发现黄芪多糖于加药后72 h促进rBMSCs增殖，可能与干细胞因子(SCF)mRNA及SCF蛋白表达升高有关。SVPB5促进rBMSCs增殖的作用是否与促进MSCs造血相关细胞因子表达相关有待进一步研究。

衰老是细胞的重要生命现象之一。MSCs与大多数正常的体细胞一样，在体外培养时有一定的寿限。有研究表明，体外培养的MSCs一旦衰老，其分化潜能和细胞表型都将发生改变，而复制性衰老是从MSCs体外培养开始就持续存在的生物学过程[8]。复制性衰老的MSCs增殖活性和分化能力降低，体内移植后其分化和归巢能力将受到限制，导致损伤组织再生能力降低，限制了MSCs作为种子细胞在细胞工程和组织工程学的应用[9]。本实验结果显示，SVPB5降低rBMSCs衰老染色阳性细胞率，缓解rBMSCs的复制性衰老，这为MSCs的细胞治疗提供了更多的保障。

综上所述，BMSCs是SVPB5作用的靶细胞群，SVPB5提高正常及辐射后rBMSCs的增殖能力，增强rBMSCs的增殖潜能，缓解正常及辐射后rBMSCs的衰老。这些作用不仅与促进辐射后骨髓重建有密切关系，还与MSCs作为作为种子细胞用于细胞治疗有密切关系。但是，SVPB5作用与正常及辐射rBMSCs的具体作用机制仍不清楚，需要进一步研究。

[1] Fouillard L, Francois S, Bouchet S, et al. Innovative cell therapy in the treatment of serious adverse events related to both chemo-radiotherapy protocol and acute myeloid leukemia syndrome:the infusion of mesenchymal stem cells post-treatment reduces hematopoietic toxicity and promotes hematopoietic reconstitution[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14(9):842-848.

[2] Bekker AY, Weeks EJ. Congnitive function after anaesthesia in the elderly [J]. Best Pract Res Clin Anaesthesiol, 2003, 17(1):259-972.

[3] 贺艳杰，孔天翰，董伟华.蝎毒多肽对辐射损伤小鼠骨髓造血干细胞及祖细胞的作用[J].中华生物医学工程杂志，2007，13(5)：272-275.

[4] 周美汛, 刘亚敏, 孔天翰, 等. 蝎毒增殖多肽对X射线辐射后大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响[J/CD].中华临床医师杂志, 2013, 7(11):4867-4872.

[5] Han W, Yu Y, Liu XY. Local signals in stem cell-based bone marrow regeneration[J]. Cell Research, 2006, 16(2):189-195.

[6] 刘铭超, 危建安, 白俊其, 等. 大黄素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及造血因子表达的影响[J].南方医科大学学报, 2014, 34(5):736-739.

[7] 黄 进, 张 进, 徐志伟, 等. 黄芪多糖对体外培养骨髓间充质干细胞增殖和干细胞因子表达的刺激作用[J]. 复旦学报, 2011, 38(4):343-348.

[8] Wagner W, Horn P, Castoldi M, et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells:a continuous and organized process[J]. PloS One, 2008, 3(5):e2213.

[9] Hwang ES. Senescence suppressors:their practical importance in replicative lifespan extension in stem cells[J]. Cell Mol Life Sci, 2014, 71(21):4207-4219.

(本文编辑:欧阳菁)

Effect of scorpion venom peptide B5 on growth of normal and irradiated rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells

HuLili,FanLingjie,XiangYongxin,PengXiang,KongTianhan,DongWeihua

(DepartmentofPathophysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China)

Objective:To observe scorpion venom peptide B5 (SVPB5) on growth of normal and irradiated rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (rBMSCs).Methods: rBMSCs were separated and purified with adherent cultivation of whole bone marrow cells, then cultured and amplified in vitro. Passage 3-5 rBMSCs were used as experimental subjects, divided into normal control group (IR-control group), normal dosing group (IR- SVPB5 group), irradiation control group (IR+control group) and the irradiation dosing group (IR+ SVPB5 group). Each group was counted for total cells, colony forming units and stained with senescence-associated β-galactosidase.Results: SVPB5 promoted proliferation of both normal and irradiated rBMSCs. Specifically, the proliferation-promoting effect became obvious as early as 3d of SVPB5 treatment in normal rBMSCs (P<0.05), which was not shown in irradiated rBMSCs until 10-11d of the treatment (P<0.05). After SVPB5 treatment, the normal rBMSCs showed significantly lower percentage of senescence β-galactosidase staining positive cells and higher counts of colony forming units, compared with the normal control group (bothP<0.05). Conclusion:SVPB5 may promote proliferation of normal and irradiated rBMSCs, enhance proliferation potential and mitigate cell aging of rBMSCs.

proliferation polypeptide scorpion venom; bone marrow mesenchymal stem cells; cell proliferation; cell aging

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.003

国家自然科学基金(81172599)

胡莉莉(1992-)，女，硕士，助理研究员。

R285.5

2095-9664(2015)05-0012-04

2014-12-21)

研究方向：肿瘤学。

*通讯作者：E-mail：dong_gz@163.com；tianhankong@163.com