野生型及突变截短型HBx转染人肝癌细胞株的蛋白组学分析

张志翔 李卫华 李 慧 张倩倩 廖东江 卢心铭

(1广州医科大学附属第一医院老年病科,广东 广州 510120；2广州医科大学呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)



·论著·

野生型及突变截短型HBx转染人肝癌细胞株的蛋白组学分析

张志翔1李卫华1李 慧1张倩倩1廖东江2卢心铭2

(1广州医科大学附属第一医院老年病科,广东 广州 510120；2广州医科大学呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)

目的:研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)羧基端31个氨基酸自然缺失突变体(HBxΔ31)对肝癌细胞蛋白质表达的影响。方法：脂质体法介导全长HBx基因和HBxΔ31突变体表达载体转染人肝癌细胞系HepG2，Western blotting分析证实HBx蛋白的表达，双向电泳分离细胞质蛋白质，图像分析HepG2-HBx及HepG2-HBxΔ31的差异蛋白表达，MALDI-TOF-MS及数据库搜索鉴定差异蛋白质。结果：在HepG2-HBxΔ31及HepG2-HBxΔ31细胞株中筛选鉴定出6个差异表达蛋白质，分别为HSPB1、RanBP1、Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta、MRP-L12，在HBxΔ31-HepG2细胞株中MRPL12、RanBP1、HSPB1高表达，Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta低表达。结论：HBx蛋白羧基端31个氨基酸突变缺失会改变肝癌细胞的蛋白质表达，这些蛋白与肿瘤的形成及转移密切相关,或可成为肝癌诊断及预后的标志物。

肝细胞癌；转染；蛋白质组

HBV X基因(HBx)是乙肝病毒基因组中最小的开放读码框(open reading frames，ORF)，也是功能重叠最明显的区域，其编码的HBx蛋白是一种多功能调节蛋白，在胞内信号转导、病毒复制转录、细胞增殖与凋亡等方面有确切作用，目前普遍认为HBx蛋白主要通过反式激活作用和信号转导途径诱导肝癌的发生[1-4]。研究表明，在HBV自身基因组和宿主基因组进行整合时，整合基因组上的HBx常常发生断裂不全，其中HBx羧基端自然缺失31AA突变体(HBxΔ31)的发生率最高，这些缺失型的突变在肝细胞的恶性转化过程中有着重要的作用[5-6]。本实验应用蛋白质组学技术分析转染全长和突变缺失型HBx的肝癌细胞株中蛋白质表达的变化情况，旨在解释肝细胞癌发生的相关机制或从中筛选出肿瘤治疗的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌细胞HepG2由本实验室冻存。将HBV感染患者血清中分离获得的野生型HBx基因和肝癌组织中分离到的HBx缺失突变体HBxΔ31，分别转染至HepG2细胞，获得稳定表达野生型HBx蛋白和HBx缺失突变体的人肝癌细胞株HBx-HepG2及HBxΔ31-HepG2。HBx-HepG2及HBxΔ31-HepG2均培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素，0.2 mg/mL G418混合液的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养液(美国Hyclone公司)、胎牛血清(美国Hyclone公司)、弱阳离子纳米磁珠试剂盒、α-氰基-4羟基肉桂酸、乙腈、三氟乙酸(TFA)、SPA、尿素、DTT；基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectronmetry，MALDI-TOF-MS)Autoflex-Ⅲ。

1.3 总蛋白收集

取处于对数生长期的两种细胞，胰酶消化后离心，PBS洗涤三次后加入裂解液(7 mol/L Urea、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、40 mmol/L Tris-Base、40 mmol/L DTT、2% Pharmalyte)，冰浴放置30 min，充分溶解后，4℃、20 000 g离心20 min后迅速取上清，即为细胞总蛋白。使用蛋白质定量试剂盒2D Quantification kit定量后-70℃冻存。

1.4 第一向电泳——等点聚焦电泳

取300 μg总蛋白样品与水化液(8 mol/L Urea、2% CHAPS、0.002%溴酚蓝和0.5% IPG Buffer)混合至350 μL，将其加入IPG胶条中，胶面向下放入槽中，每根胶条上覆盖1 mL矿物油，按如下条件等电聚焦：30 V，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1 500 V，0.5 h；8 000 V，1 h;8 000 V，48 000 V h。

1.5 SDS-PAGE

将等电聚焦后的IPG胶条放入10 mL平衡液1(50 mmol/L Tris-Base、6 mol/L Urea、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚兰、0.2% DTT)和10 mL平衡液2(50 mmol/L Tris-Base、6mol/L Urea、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚兰、3%碘乙酰胺)中各平衡15 min。再将平衡后的IPG胶条放入SDS-PAGE胶上，用含有溴酚兰的0.5%琼脂糖凝胶封口后在Ettan DALT SIX 垂直电泳槽中进行SDS-PAGE，电泳设置恒温25℃，恒电流15 mA/gel先运行15 min，后20 mA/gel，当溴酚蓝指示剂达到胶条的底线1 cm时停止电泳。

1.6 染色

将跑完的胶转移到染色盒中固定30 min，考马斯亮蓝G-250染色，摇床过夜。脱色液脱色至背景无色。

1.7 图像获取与分析

染色后的凝胶经ImageScanner扫描仪扫描获得蛋白质点图谱，利用Imagine master软件对图像进行分析.

1.8 质谱分析与数据库查询

质谱鉴定和匹配在广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室完成。

2 结 果

2.1 双向电泳图谱建立及蛋白点差异分析。

在相同条件下，对两组细胞株的蛋白质样品分别进行了3次双向电泳，其蛋白质分布模式图极为相似，蛋白斑点多集中于pI4-7，相对分子质量15～75 ku区域内。经ImageMaster 2D Platinum软件分析，HBx-HepG2平均蛋白质点数为(964±33)个，HBx-31-HepG2蛋白质点数为(998±37)个，组内匹配率分别为84.3%和82.2%，组间匹配率为77.1%。电泳图像经分析和匹配，识别出19个差异较大蛋白点，从中选出10个等电点分布不同，差异方向不同的蛋白点进行鉴定。见图1。

A.HBx-HepG2;B.HBxΔ31-HepG2

图1 转染野生型及缺失突变型HBx人肝癌细胞株的二维电泳凝胶图谱(考染)

2.2 质谱及数据库检查结果

对筛选到的10个差异表达蛋白质斑点进行MALDI-TOF-MS分析、数据库检索，有6种蛋白斑点得到鉴定，分别为HSPB1、RanBP1、Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta、MRP-L12。其中MRPL12、RanBP1、HSPB1在HBxΔ31-HepG2细胞株中高表达，Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta低表达。见表1。

表1 10个差异表达蛋白质斑点检索结果

3 讨 论

本组前期研究发现，HBx羧基端缺失的突变体对细胞增殖和侵袭具有完全不同于野生型HBx生物学效应，因此本研究采用双向电泳和凝胶分析法，从蛋白质组角度了解这种差异涉及的相关蛋白质。相比于全长HBx蛋白，存在羧基端缺失31AA的HBx基因对机体生物学功能影响可能主要包括：①反式激活作用发生改变： HBx蛋白由2个结构域构成，其中羧基端的51-154位氨基酸构成反式调控区域，该区域是HBx蛋白发挥反式激活作用的部位，编码该区域的基因发生突变会使其反式激活作用发生改变；②影响细胞信号通路：HBx在低表达时主要位于细胞核，而高表达时主要存在于细胞质中，胞质中的HBx可影响多种信号转导通路，信号通路之间又相互影响，会形成更为复杂的信号网络，因此HBx的突变可对整个信号通路造成极大影响；③影响细胞增殖和凋亡：细胞增生调节异常和细胞凋亡机制受损是肿瘤发生的重要原因。HBx突变引起HSPs、MRPs等蛋白表达出现异常，而HSPs作为分子伴侣可以通过多种方式抑制细胞凋亡，MRPs可通过影响细胞能量代谢障碍影响细胞凋亡[7-9]。④影响细胞骨架结构： HSP27、戴帽蛋白Z(CapZ)与细胞骨架组织互相作用，在肿瘤组织中高表达，可保护癌细胞免受应激产生的损伤[7,10,11]。⑤影响miRNA的表达：如miR-151，作为与肝癌肝内转移相关的一种miRNA，miR-151可直接通过肝癌转移抑制因子Rho GDIα而发挥功能，而在HBx羧基端缺失突变过程中Rho GDIα表达发生了明显的改变[12-14]。

综上所述，转染有全长及羧基端缺失HBx基因的肝癌细胞株中蛋白质表达有着明显的不同，这些改变涉及细胞功能的多个方面，且多数与肿瘤的发生发展密切相关。越来越多的研究证实HBx在肝癌发生的各个阶段均起着重要的作用，但其具体的分子机制仍不明确，需进一步深入研究。

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(本文编辑:张辉)

·医学新闻·

不进早餐者血脂异常风险较高

据医学论坛网报道，华中科技大学同济医学院附属协和医院内分泌科张皎月、万丽敏和曾天舒等研究了湖北省宜昌市夷陵地区40岁及以上居民早餐频率与血脂异常的关系。结果表明，不进早餐者血脂异常的风险较规律进早餐者高,养成规律进早餐的习惯对于预防血脂异常的发生可能有重要的作用。相关论文发表于2015年第8期《中华内分泌代谢杂志》。

研究者们采用随机整群抽样的方法于2011至2012年调查夷陵地区居民共10 420名。结果显示，血脂异常的患病率高达64.0%,其中女性的患病率高于男性(65.9%对60.6%)。与规律进食早餐组相比,不进食早餐组高低密度脂蛋白胆固醇血症及高甘油三酯血症的患病率明显增高。调整年龄、性别、吸烟、饮酒等后,不同早餐频率与高低密度脂蛋白胆固醇血症仍相关(OR=2.382, 95%CI 1.300～4.367,P=0.019)。

Proteomic analysis of wild-type and mutant truncated HBx-transfected human hepatoma cell line

ZhangZhixiang1,LiWeihua1,LiHui1,ZhangQianqian1,LiaoDongjiang2,LuXinming2

(1DepartmentofGeriatrics,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120;2GuangzhouInstituteofRespiratoryDisease,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China)

Objective:To investigate the effects of a natural deletion mutant of hepatitis B virus X protein (HBx) with truncation of 31 amino acids at the carboxy-terminal (HBxΔ31) on protein expressions in liver cancer cells.Methods:Liposome-mediated transfection of full-length and HBxΔ31 mutant HBx genes into human hepatoma cell line HepG2 was performed. Western blotting was used to confirm the expression of HBx proteins. Two-dimensional electrophoresis was employed to separate the cytoplasmic proteins. The differential protein expression of HepG2-HBx and HepG2-HBxΔ31 was studied by imaging analysis. MALDI-TOF-MS and database search were used to identify the differentially expressed proteins.Results: Screening of HepG2-HBxΔ31 and HepG2-HBxΔ31 cell strains yielded 6 differentially expressed proteins:HSPB1, RanBP1, Rho-GDI alpha, Serpin B5, CapZ beta and MRP-L12. In HBxΔ31-HepG2 cell strains, we found up-regulated expression of MRPL12, RanBP1 and HSPB1, compared with down-regulated expression of Rho-GDI alpha, Serpin B5 and CapZ beta.Conclusion:Deletion mutation of HBx with truncation of 31 amino acids at the carboxy-terminal may alter protein expression in hepatoma cells. These proteins are closely related to tumor formation and metastasis, and therefore can become biomarkers for diagnostic and prognostic evaluation in liver cancer.

hepatocellular carcinoma; transfection; proteome

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.005

张志翔(1989-),男，硕士，助理研究员。

R735.7

2095-9664(2015)05-0020-04

2015-02-11)

研究方向：HBVSHCC发生发展相关性研究。