足底电击加强大鼠凝血功能的研究*

程玉文，孙珮雯，朱晨洁，董涛，张国兴（苏州大学医学部基础医学与生物科学学院生理学系，江苏苏州215123）

足底电击加强大鼠凝血功能的研究*

程玉文，孙珮雯，朱晨洁，董涛，张国兴
（苏州大学医学部基础医学与生物科学学院生理学系，江苏苏州215123）

摘要：目的研究足底电击对大鼠凝血系统的影响及机制。方法以SD雄性大鼠足底电击建立模型，分为对照组、电击组、假手术组、去神经电击组和注射抗氧化剂电击组，每组6只大鼠。尾套法测量大鼠的收缩压，凝血分析仪测定血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）及血浆凝血酶（TT），血小板聚集仪测定二磷酸腺苷（ADP）介导血小板聚集和胶原介导血小板聚集，酶联免疫吸附法（ELISA）测定血浆中脂质过氧化产物、谷胱甘肽、皮质酮浓度，观察各项指标的变化。结果足底电击大鼠7 d后，电击组和假手术组收缩压明显高于对照组（P<0.05）。足底电击14d后，电击组和假手术组血浆中谷胱甘肽活性较对照组降低（P<0.05），电击组和假手术组血浆中脂质过氧化物、皮质酮浓度相对于对照组升高（P<0.05），与对照组比较，电击组和假手术组PT缩短，TT延长（P<0.05），电击组和假手术组的ADP和胶原介导血小板聚集率高于对照组（P<0.05），电击组和假手术组比较差异无统计学意义。与电击组比较，去神经电击组和注射抗氧化剂电击组收缩压、血浆中脂质过氧化物、皮质酮浓度、ADP和胶原介导血小板聚集率降低（P<0.05）。结论足底电击通过激活肾交感神经和增加氧化应激使大鼠凝血功能增强。

关键词：凝血功能；足底电击；氧化应激；肾交感神经

人们长期处于紧张焦虑状态易导致心血管疾病，同时，抑郁焦虑会加速心血管疾病的形成。在过去的几十年里，压力和抑郁被公认是影响健康的重要因素[1]。压力可能与脑卒中、心肌梗死密切相关[2]。大量研究表明,长期持续的应激可以对组织和器官造成器质性损伤[3]。肾交感神经和氧化应激在应激性高血压的发生和发展中起重要作用，高血压可加重血管内皮功能障碍，促进血栓形成，与心脑血管疾病发病密切相关[4-5]。目前，关于精神应激与凝血系统、心脑血管疾病间的直接联系，未见相关报道。凝血系统的激活与对生理性止血和病理性血栓形成有重要影响[6-7]。本研究计划通过足底电击大鼠建立应激模型[8]，探索大鼠凝血功能的变化及具体机制。

1　材料与方法

1.1动物

成年雄性SD大鼠24只，体重200～250 g，由苏州大学医学部实验动物中心提供。将大鼠随机分为对照组、电击组、假手术组、去神经电击组和注射抗氧化剂电击组，每组6只。选用一种超氧化物歧化酶模拟剂Tempol作为抗氧化剂，每天对去神经电击组和注射抗氧化剂电击组的大鼠腹腔注射该药物100 mg/kg，浓度为10%，注射时间为电击实验前1 h。

1.2仪器和试剂

RBP21B型大鼠血压心率仪购自北京新航兴业科贸有限公司，半自动血凝分析仪购自广州华鑫科技有限公司，血小板聚集仪购自上海曼普科技有限公司，ELISA检测试剂盒购自美国R&D Systems公司。

1.3实验方法

1.3.1模型制备①应激模型制备：电击组大鼠刺激周期为15 d，每天上、下午各给予1次足底电刺激，2h/次，电流强度为2～4mA，电压输出为75～150 V；对照组大鼠每天于同样时间置于相同的鼠箱，但不予应激刺激。②去神经组模型制备：将雄性SD大鼠麻醉（腹腔注射1 ml/100 g的水合氯醛溶液）后，经腰部纵行切口，沿腹膜后路径暴露左侧肾脏、肾动脉和肾神经，于接近腹主动脉处的肾动脉和肾静脉附近仔细游离出肾交感神经，用手术剪切断后缝合，右侧同左侧，术后静养1周，去肾交感神经大鼠模型制备成功。

1.3.2标本采集下腔静脉取血或者断头取血5 ml，用3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝，混匀，置入-80℃保存全血标本备用。

1.3.3大鼠收缩压测定实验开始后每3天为1个周期，尾套法测定收缩压。测量血压前大鼠预置于38～40℃温室10～20 min，尾部动脉扩张后，将尾部套于传感器上，待动物适应环境、行为稳定后，开主机电源。连续测3次，取其均值，每次测量在下午应激后0.5 h进行。

1.3.4大鼠凝血功能检测静脉采血1.8 ml，加入含有3.8%枸橼酸钠溶液0.2 ml的试管中，充分混匀，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，试管中加入预温的SD大鼠冻干血浆和PT试剂各0.1 ml，混匀后放入仪器进行测试。TT、APTT测量方法同理，但是APTT测试时另加入25 mmol/L氯化钙溶液0.1 ml。

1.3.5血小板聚集率使用血小板聚集仪测量血小板聚集率，静脉采血0.9 ml，加入含有3.8%枸橼酸钠溶液0.1 ml的试管中，充分混匀，1 500 r/min离心15 min，分离血浆，分别用6×10-6mol/L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、20 mg/L胶原介导，实验步骤参考血小板聚集仪操作手册。

1.3.6血浆中脂质过氧化产物、皮质酮浓度、谷胱甘肽活性测定采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定皮质酮；使用4-羟基壬烯酸-His加合物ELISA检测试剂盒测定脂质过氧化产物；使用皮质酮活性分析试剂盒测定皮质酮活性；使用谷胱甘肽过氧化酶ELISA测定试剂盒测定谷胱甘肽活性。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组均数作正态性检验及重复测量方差齐性检验，单因素方差分析进行组间比较（F检验），P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组收缩压随电击天数的变化

连续电击7d后，电击组和假手术组大鼠的血压明显高于对照组（P<0.05），这种状态在后续1周的电击中一直持续，提示足底电击所造成的应激状态可导致高血压的发生。去神经电击组和注射抗氧化剂电击组与电击组比较，收缩压明显降低。假手术组与电击组比较差异无统计学意义，提示肾交感神经和氧负离子在电击诱导的高血压中起重要作用。见图1。

2.2各组血浆中脂质过氧化产物、谷胱甘肽活性、皮质酮浓度比较

电击组和假手术组血浆中谷胱甘肽活性较对照组均有降低（P=0.010和0.008），提示机体电击后抗氧化能力降低，机体处于超氧化状态。电击组和注射抗氧化剂电击组血浆中谷胱甘肽活性较去神经电击组无明显改变，但可显著降低血浆中脂质过氧化产物浓度（P<0.05），提示去神经和注射抗氧化剂无法提高机体自身的抗氧化能力，肾交感神经激活可诱导机体氧化水平的失衡。皮质酮是常见的应激激素，能清晰地反应出应激水平，脂质过氧化产物浓度分析可反映脂质过氧化的水平。电击组和假手术组血浆中脂质过氧化产物和皮质酮浓度相对对照组升高，说明长期电击使机体产生大量氧自由基，肾上腺分泌大量皮质酮。注射抗氧化剂电击组血浆中皮质酮浓度较电击组有显著降低（P<0.05），提示机体肾交感神经激活引起的肾上腺分泌大量皮质酮释放可能有氧负离子的参与。见表1。

2.3各组凝血指标比较

电击组和假手术组血浆凝血酶时间（thrombin time，TT）较对照组延长（P=0.002和0.011），提示体内的抗凝物质增多，而血浆凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）则缩短，提示凝血酶原转化为凝血酶时间缩短，内源性凝血系统激活所需时间变少，血栓更易形成。去神经和抗氧化剂处理可以缩短TT（P=0.046和0.022），但对PT没有影响。见表2。

2.4各组血小板聚集率比较

图1　各组收缩压随电击天数的变化

表1　各组血浆中脂质过氧化产物、谷胱甘肽活性及皮质酮浓度比较（n=6±s）

表1　各组血浆中脂质过氧化产物、谷胱甘肽活性及皮质酮浓度比较（n=6±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与电击组比较，P<0.05

组别　脂质过氧化产物/（μmol/ml）　谷胱甘肽/ （u/L）　皮质酮/ （ng/ml）对照组　108.20±1.65　141.56±3.24 182.99±5.51电击组　136.47±3.571）128.52±2.981）227.56±6.671）P值　0.000　0.010　0.000假手术组　138.49±3.071）127.38±2.931）230.52±4.431）P值　0.000　0.008　0.000去神经电击组　119.55±3.322）120.41±4.071）161.90±2.922）P值　0.002　0.001　0.000注射抗氧化剂电击组　111.11±3.922）120.44±1.991）162.51±6.742）P值　0.000　0.000　0.000

表2　各组凝血指标比较（n=6，s±s）

表2　各组凝血指标比较（n=6，s±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与电击组比较，P<0.05

组别　TT　PT　APTT对照组　47.98±0.55　11.97±0.47 19.85±0.14电击组　64.65±2.751）　10.4±0.151）19.05±0.87 P值　0.002　0.021　0.673假手术组　53.52±3.031）　11.22±0.921）20.22±0.98 P值　0.011　0.070　0.728去神经电击组　56.30±2.412）　11.03±0.52 19.72±1.26 P值　0.046　0.327　0.673注射抗氧化剂电击组　53.25±3.162）　11.25±0.35 18.28±2.11 P值　0.022　0.077　0.752

电击组和假手术组的ADP和胶原介导血小板聚集率均高于对照组（P<0.05），提示电击能激活血小板的聚集。去神经和注射抗氧化剂处理均可以抑制电击引起的ADP和胶原介导的血小板聚集率升高，电击组与假手术组的血小板聚集率比较，差异无统计学意义，排除开腹手术的影响，提示电击引起的凝血功能的改变是由肾交感神经及氧负离子介导。见图2。

图2　各组血小板聚集率

3　讨论

本实验前期基础研究表明，长期足底电击导致大鼠血压升高形成应激性高血压，肾交感神经和氧化应激在其发生和发展过程中起重要作用。高血压可加重血管内皮功能障碍，促进血栓形成，与心脑血管疾病发病密切相关，交感神经与氧化应激在心脑血管疾病中发挥的作用不容小觑。

凝血是一系列血浆凝血因子相继酶解激活的过程，最终结果是生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块[9]。凝血过程一般分为内源性凝血和外源性凝血。APTT是内源性凝血系统的筛选实验；PT是外源凝血系统凝血因子缺陷的过筛实验；TT是凝血酶原转变成凝血酶的时间。TT和APTT的延长提示凝血功能下降[10]。本实验结果显示，应激状态下TT和APTT都延长，可能是由于应激造成凝血相关环节损伤，且与凝血酶的生成时间延长关系密切，从而造成凝血时间延长，但本实验中该差异无统计学意义。而PT的缩短则表明外源性凝血系统易于激活，启动凝血机制，且差异有统计学意义。

血小板主要来源于巨核细胞，在初级止血中起重要作用，血小板发生聚集后，产生凝血功能[11]。血小板通过各种黏附、聚集、释放反应，产生止血功能[12]。血小板聚集增强说明凝血功能增强。血小板聚集是动脉硬化发生、发展和血栓形成的重要环节[13-14]。

1985年有学者提出激素学说，该学说认为应用激素引起血液高凝，导致血管内血栓形成，造成微循环阻塞。本实验中测得血浆中皮质酮浓度在电击后增加，说明电击后在应激激素皮质酮作用下，血液处于高凝状态，而切断肾交感神经后，减弱肾皮质激素的释放缓解这种高凝状态。谷胱甘肽的减少、脂质过氧化产物的增加均提示机体处于超氧化水平，血管内皮损伤为血小板聚集创造有利条件，所以氧自由基增加，致使血液处于高凝状态。

综上所述，足底电击导致大鼠血压的升高，激活凝血系统，引起微循环障碍，导致心脑血管疾病。凝血系统的激活有两条途径：①应激使机体产生大量脂质过氧化产物，抑制抗氧化剂谷胱甘肽的产生，使机体处于超氧化状态，血管内皮受损，血小板活化聚集率增高，血栓易于形成；②应激状态下交感神经释放皮质激素，血液处于高凝状态。但是应激对凝血时间的影响是否具有意义，以及其具体环节有待进一步研究。应激激活凝血系统后，可以通过增加血栓数量，诱发脑卒中和冠状动脉粥样硬化性心脏病；另外动脉粥样硬化也增加心肌梗死的发病率，因此可以在神经激素水平和抗氧化剂水平上，对心脑血管方面的疾病进行预防和治疗。

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（申海菊编辑）

Foot shock potentiates blood coagulation system of rats*

Yu-wen CHENG, Pei-wen SUN, Chen-jie ZHU, Tao Dong, Guo-xing ZHANG (Department of Physiology and Neurobiology, Medical College of Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215123, P.R. China)

Abstract:【Objective】To observe the influence of foot shock on blood coagulation system of rats. 【Methods】A foot shock model was established in male Sprague Dawley (SD) rats. They were divided into control group, foot shock group, sham group, renal sympathetic nerve denervation plus foot shock group and tempol plus foot shock group with 6 in each group. Tail-cuff method was applied to measure the systolic blood pressure in the rats. Semi-automatic blood coagulation analyzer was applied to measure TT, PT and APTT. Platelet aggregation instrument was used to measure ADP and collagen induced platelet aggregation. Concentrations of plasma thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), corticosterone and glutathione peroxidase activity (GSH-Px) were measured by ELISA kits.【Results】The systolic blood pressure of the shock group and the sham group was significantly higher than that of the control group 7 days after foot shock (P< 0.05). The plasma GSH-Px activity was decreased in the shock group and the sham group compared to that in the control group 14 days after foot shock (P< 0.05). The plasma concentrations of TBARS and corticosterone were increased in the foot shock group and the sham group compared with that in the control group (P< 0.05). PT of the foot shock group and the sham group was shortened compared with that in the control group, but TT was extended (P< 0.05). Platelet aggregation rates induced ADP and collagen in the foot shock group and the sham group were significantly higher than those in the control group (P< 0.05), however, there were no significant differences in the rates between the shock group and the sham group. Both renal sympatheticbook=19,ebook=25denervation and tempol treatments reduced systolic blood pressure, plasma TBARS and corticosterone level, and ADP and collagen induced rates of platelet aggregation compared with the shock group (P< 0.05).【Conclusion】Foot shock of rats enhances blood coagulation system through renal sympathetic nerve system activation and increase of oxidative stress.

Key words:coagulation function; foot shock; oxidative stress, renal sympathetic nerve system

[通信作者]张国兴，E-mail：zhangguoxing@suda.edu.cn

*基金项目：国家级大学生创新训练项目（No：2013suda038）

收稿日期：2014-12-30

文章编号：1005-8982（2015）23-0018-05

中图分类号：R363

文献标识码：A