环氧化酶-2与p53在恶性黑色素瘤组织中的表达意义及相关性分析*

冯浩，冯亚兰，旷翎，徐晓芃，贾晓敏，吴东辉（.湖南省人民医院皮肤科，湖南长沙0005；.湖南省郴州市第一人民医院，湖南郴州000；.湖南省人民医院病理科，湖南长沙0005；.湖南省人民医院整形美容科，湖南长沙0005）

环氧化酶-2与p53在恶性黑色素瘤组织中的表达意义及相关性分析*

冯浩1，冯亚兰2，旷翎1，徐晓芃1，贾晓敏3，吴东辉4
（1.湖南省人民医院皮肤科，湖南长沙410005；2.湖南省郴州市第一人民医院，湖南郴州423000；3.湖南省人民医院病理科，湖南长沙410005；4.湖南省人民医院整形美容科，湖南长沙410005）

摘要：目的探讨恶性黑色素瘤组织中环氧化酶-2（COX-2）与p53的表达，明确其在恶性黑色素瘤发生、发展中的临床意义。方法收集恶性黑色素瘤组织和色素痣患者各30例，采用免疫组织化学检测组织中COX-2和p53表达，并与临床资料进行相关性分析。结果COX-2和p53蛋白在恶性黑色素瘤组织中表达阳性率高于色素痣组（P<0.01）。恶性黑色素瘤组织中COX-2与p53的表达呈正相关（r=0.452，P=0.015）。恶性黑色素瘤中COX-2表达在年龄、性别分组中，差异无统计学意义（P>0.05）。而恶性黑色素瘤病理分期Ⅲ、Ⅳ期患者的COX-2阳性率显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.01）；有淋巴结转移患者的COX-2阳性率高于无淋巴结转移患者（P<0.05）。结论COX-2可能为判定MM恶性程度的一种标志，可能通过p53突变，导致COX-2表达增强，从而在恶性黑色素瘤中发生作用。

关键词：恶性黑色素瘤；COX-2；p53；临床意义

临床上，恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）呈逐年增多的趋势，目前将其临床发生、发展机制的研究转至对分子途径的研究[1]。组织学中MM有血管增生，其新生血管增生与多种促血管因素有关。研究发现，环氧化酶-2（Cyclooxygenase，COX-2）表达与MM发展有关[2-4]。本研究主要探讨COX-2和p53在MM中的表达及临床意义。

1　资料与方法

1.1临床资料

选取2011年1月-2014年6月在湖南省人民医院、长沙市中医医院（市八医院）和长沙市马王堆疗养院门诊及住院诊断为MM的患者30例，均经临床、病理活检及免疫组织化学（S-100和HMB45阳性）确诊。其中男性22例，女性8例；年龄29～82岁，平均51岁；病程2～36个月，平均10个月。收集并记录患者临床资料，根据恶性黑色素瘤TNM分期（美国癌症联合委员会第7版），Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ、Ⅳ期19例。色素痣组30例来自湖南省人民医院皮肤科与整形外科门诊色素痣患者。其中皮内痣12例，交界痣9例，混合痣9例；男性11例，女性19例；年龄18～62岁，平均46岁。两组患者年龄、性别比较，差异无统计学意义（P>0.05）。所有患者切除的组织立即放入4%福尔马林液固定过夜，常规石蜡包埋，4μm切片，覆盖于多聚赖氨酸处理过的玻片上备用。

1.2免疫组织化学法检测组织中COX-2和p53表达

COX-2和p53单克隆抗体及免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术公司。采用Envision两步法：石蜡常规切片，二甲苯脱蜡梯度酒精水化后放进水浴锅中，100℃、40 min行抗原热修复，切片滴加3%链酶菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育20 min以消除内源性过氧化物酶活性。切片分别滴加COX-2和p53一抗工作液，孵育1 h后再以Envision/辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）（即用型试剂）室温孵育30～45 min。磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗，每次5 min，共冲洗3次，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色，在光镜下控制，显色充分后用自来水终止。苏木精复染1 min，常规水性封片剂封片。以购买的阳性片作为阳性对照组，以PBS代替一抗作为阴性对照组。

阳性标准：细胞浆内（COX-2）或细胞核内（p53）出现棕黄色或棕褐色反应物颗粒即为阳性。每张切片观察5个独立高倍视野（×400），根据实验结果判定阴性或阳性。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料用率表示，用χ2检验，相关分析用Kendalls’taub等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1COX-2的表达

30例MM组患者中，COX-2阳性24例（80.00%）；30例色素痣组患者中，COX-2阳性4例（13.33%）。两组COX-2阳性率比较差异有统计学意义（P=0.000）。见图1A和表1。

2.2p53的表达

MM组p53阳性22例，达73.33%；色素痣组p53阳性7例，为23.33%。两组p53阳性率比较差异有统计学意义（P=0.001）。见图1B和表2。

2.3MM组中COX-2与p53表达的相关性

附图　恶性黑素瘤组织中COX-2与p53表达（免疫组织化学）

表1　两组患者COX-2表达比较例

24例COX-2阳性表达的MM组织中，p53阳性表达20例；6例COX-2阴性表达的MM组织中，p53阳性表达2例；经相关性分析，MM组织中COX-2与p53的表达呈正相关（r=0.452，P=0.015）。见表3。

2.4COX-2与MM患者临床资料的相关性

观察COX-2与患者年龄、性别、病理分期、有无淋巴结转移的相关性。结果显示，中COX-2阳性率与MM患者的年龄、性别不相关（P>0.05）。而MM病理分期Ⅲ、Ⅳ期患者的COX-2阳性率显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.01）；有淋巴结转移患者的COX-2阳性率高于无淋巴结转移患者（P<0.05）。见表4。

表2　两组患者p53表达比较　例

表3　MM组织中COX-2与p53表达的相关性例

表4　COX-2与MM患者临床资料的相关性例（%）

3　讨论

目前，对分子标记用于区分色素痣和MM的关注越来越多，尤其是早期发现和治疗MM的标记物。COX-2为炎症性的诱导型酶，某些物质可以诱导其在体内组织中产生，如炎症细胞因子、肿瘤启动因子、生长因子和致癌物质等。COX-2在正常组织中一般无表达，而在肿瘤组织中高度表达，提示其可能与肿瘤的发生、发展有关，并且多表达于恶性生长的上皮细胞[5]。有文献报道，COX-2与胃癌、乳腺癌、人肝细胞肝癌、结直肠癌、鳞状细胞癌等密切相关[6-10]。COX-2表达高的肿瘤细胞对凋亡抵抗、血管形成因子生成、转移以及促血管内皮细胞迁移的能力增强。COX-2催化产生前列腺素E2并产生一系列效应，如细胞增殖、促进血管生成、抑制细胞凋亡、刺激肿瘤侵袭和抑制免疫应答[11-12]。有报道称COX-2可能有助于区分皮肤黑素瘤与色素痣[13]。鉴于通过组织病理形态学很难明确区分良、恶性病变，COX-2鉴别早期皮肤黑素瘤和色素痣的研究就显得极为有意义。

关于MM中COX-2的作用机制少有报道。近年有研究发现，COX-2高表达可能与MM的进展有关[14]。而COX-2蛋白在原发性黑素瘤中未检出，在周围炎症细胞和转移性肿瘤中却有少许表达。本研究发现，MM组中COX-2表达（80.00%）明显高于色素痣组（P<0.01），同时病理分期、有无淋巴结转移与MM中COX-2表达相关（P<0.05），TNM分期高和/或伴有淋巴结转移的患者阳性率高。类似研究证实，乳腺癌中COX-2表达与有无淋巴结转移密切相关，胃癌原发灶中COX-2的阳性表达与胃癌TNM分期密切相关[15-16]。此外，COX-2高表达可降低介导细胞间黏附的E-钙黏蛋白活性，提高细胞与细胞外基质蛋白黏附能力，增加肿瘤细胞的侵袭力；相反使用COX -2抑制剂能增加E-钙黏蛋白活性[17]。因此COX-2高表达可能与黑素瘤细胞侵袭能力和转移性生长有关。COX-2有可能成为评估MM患者病情与预后的一个重要指标。

目前已发现参与细胞凋亡的关键分子，如促凋亡基因p53、Fas/FasL、Noxa、p53上调凋亡调控因子、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体等。其中p53基因是一种功能强大的可诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的抑癌基因，其分为突变型基因和野生型基因两种。突变型p53基因较野生型更稳定，能在免疫组织化学检测中发现。因此在组织中有高表达p53蛋白，即表明有p53基因的突变[18]。p53基因在黑素瘤的发生、发展过程中起重要作用。正常条件下，p53基因产物可抑制COX-2的表达，而p53基因突变的细胞，COX-2表达增强。本研究显示，MM组p53的阳性表达率为73.33%，高于色素痣组p53的表达（23.33%）（P<0.01），与其他文献报道相似[19]，且MM组织中COX-2与p53表达呈正相关。

综上所述，MM中COX-2高表达可能是一种生物学恶性程度高、预后不良的标志，可能通过p53突变而使COX-2抑制减弱，导致其表达增强，促进肿瘤新生血管形成，肿瘤细胞凋亡减少，从而促进MM的发生、发展。因此，研究COX-2可能为早期诊断MM、观察该病发生与进展、预判肿瘤的恶性程度提供重要参考依据。

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（申海菊编辑）

Clinical value of expressions of COX-2 and P53 in malignant melanoma*

Hao FENG1, Ya-lan FENG2, Ling KUANG1, Xiao-peng XU1, Xiao-min JIA3, Dong-hui WU4(1. Department of Dermatology, Hunan Provincial People's Hospital, Changsha, Hunan 410005, P.R. China; 2. The First People's Hospital of Chenzhou, Chenzhou, Hunan 423000, P.R. China;
3. Department of Pathology, 4. Department of Plastic Surgery, Hunan Provincial People's Hospital, Changsha, Hunan 410005, P.R. China)

Abstract:【Objective】To observe the clinical value of the expressions of COX-2 and P53 in malignant melanoma (MM).【Methods】Thirty patients with MM and thirty cases of nevus were collected. The expressions of COX-2 and P53 were detected by immunohistochemical method and the correlation between the expression of COX-2 and clinical data was analyzed.【Results】The expressions of COX-2 protein and P53 protein in MM tissue were statistically higher than those in nevus (P< 0.01). There was a statistically significant positive correlation between the expression of COX-2 and P53 (r = 0.452, P< 0.05). There was no statistically differences of COX-2 expression in MM patients with different age and gender (P> 0.05), while the positive rate of COX-2 in the stageⅢandⅣMM patients was significantly higher than that in the stageⅠandⅡpatients (P< 0.01). The positive rate of COX-2 in the patients with lymph node metastasis was higher than that in the patients without lymph node metastasis (P< 0.05).【Conclusion】COX-2 may become a new symbol for judging the malignant degree of malignant melanoma, which is supposed to be activated by p53 mutation.

Key words:malignant melanoma; COX-2; P53; clinical value

[通信作者]吴东辉，E-mail：doctorwudonghui@126.com

*基金项目：湖南省自然科学基金青年基金（No：09JJ4011）；湖南省人民医院仁术科研基金（No：2008-14）

收稿日期：2015-02-17

文章编号：1005-8982（2015）23-0028-04

中图分类号：R739.5

文献标识码：A