大鼠卵巢组织冷冻复苏及自体异位移植研究

李冬秀，耿杨柳，吴小华，于晓惠，张　敏，徐清华



大鼠卵巢组织冷冻复苏及自体异位移植研究

李冬秀，耿杨柳，吴小华，于晓惠，张敏，徐清华

[摘要]目的探讨直接覆盖玻璃化冷冻(direct cover vitrification， DCV)在冷冻大鼠卵巢组织中的效果，并对自体异位移植后卵巢组织存活状况及内分泌情况进行分析。方法性成熟的Wistar大鼠50只随机分为A、B、C、D组，A和B组各20只，C和D组各5只。A组为新鲜卵巢组织移植；B组卵巢组织经DCV冷冻保存2周复苏后移植；C组为去势对照；D组为假手术对照。自体异位移植6周后检测大鼠血清中雌二醇(E2)水平，计算卵泡密度，观察移植卵巢组织形态学及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达情况。结果大鼠卵巢组织移植存活的卵巢组织周围可见血管供应，移植失败的卵巢组织呈纤维化状态，与周围组织血供不明显。B组卵巢组织移植存活率低于A组(P<0.05)。B组卵巢组织中卵泡密度均低于A、D组，且A组低于D组(P<0.05)。A、B组血清E2水平高于C组，低于D组(P<0.05)。A、B组卵巢组织PCNA阳性率均低于D组，且B组低于A组(P<0.05)。结论大鼠卵巢组织经DCV法冻融自体异位移植后部分卵泡能存活并可恢复内分泌功能。

[关键词]卵巢；玻璃化作用；低温保存；移植物存活；移植,自体；大鼠,Wistar

近年，女性恶性肿瘤发病率逐年升高且渐趋年轻化。美国一项数据调查显示<40岁女性恶性肿瘤发病率为10%。随着肿瘤综合治疗技术的进步，女性肿瘤患者的生存率得到大幅提高，但是大剂量放化疗导致的卵巢早衰、生育能力丧失及女性内分泌失调等问题亟待解决[1-2]。如何在恶性肿瘤得到治疗后继续保持女性原有内分泌及生育功能是肿瘤学和生殖内分泌学领域关注的热点。目前，保存女性生育能力最常用的方法为胚胎冷冻、卵母细胞冷冻及卵巢组织冷冻。胚胎冷冻技术已是稳定成熟的技术，目前广泛应用于人类辅助生殖，但是只适合于有配偶的女性，而且还需长时间促排卵治疗，对于有些肿瘤患者如雌激素依赖性肿瘤是不适合的[3]。卵巢组织冷冻不需要药物诱发排卵，因此不会耽误原有肿瘤的治疗。卵巢组织皮质中保存有大量的窦卵泡，如果能将卵巢组织进行冷冻复苏，保存其中的窦卵泡，再移植到自体、异体或直接将卵巢组织进行体外培养，有望保存患者的生育能力，并且有助于恢复女性内分泌功能，有效提高患者生活质量。本研究建立了大鼠卵巢组织自体移植模型，观察新鲜卵巢组织和经直接覆盖玻璃化冷冻(direct cover vitrification， DCV)复苏后的卵巢组织异位移植后的生长情况，旨在为冻融人类卵巢组织探索合理的方案。

1材料与方法

1.1实验动物与分组成熟雌性Wistar大鼠50只(购自河北医科大学动物研究中心)，8～10周龄，体重200～220 g。将大鼠随机分为A、B、C、D组，A、B组各20只，C、D组各5只。A组(新鲜移植组)：手术摘除双侧卵巢组织后将皮质进行自体异位移植；B组(DCV组)：手术摘除双侧卵巢组织，将卵巢组织取材冷冻保存2周后，解冻卵巢组织，进行自体异位移植；C组(去势对照组)：只切除双侧卵巢组织，不进行卵巢移植，旨在观察卵巢切除是否彻底；D组(假手术组)：对大鼠进行开关腹手术，不对卵巢进行操作。本研究经解放军白求恩国际和平医院伦理委员会批准,于该院动物实验中心进行，该中心达到SPF条件。对动物处置符合科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

1.2标本采集给予1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒、开腹，手术切除双侧完整卵巢。用生理盐水反复冲洗卵巢组织至少3遍，将卵巢皮质切成2 mm×2 mm×4 mm的小块，用于后续研究。术后对大鼠手术切口进行聚维酮碘消毒，肌内注射青霉素，2/d，连续用药7 d。

1.3DCVDCV过程参考Chen等[4]方法，所有操作均在室温下进行，将卵巢组织块浸入平衡液[7.5%乙二醇(v/v)+7.5%二甲基亚砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，渗透平衡15 min，再移入冷冻液[15%乙二醇(v/v)+15%二甲基亚砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，渗透平衡5 min。轻柔夹取卵巢组织皮质，置于1.8 ml无菌冷冻管中，将冷冻管用清洁液氮充满密封，投入贮存液氮罐中备用。

1.4复苏冷冻2周后从液氮罐中取出冷冻管，37℃水浴中解冻30 s，将卵巢组织块依次移入含0.5、0.25、0.125 mol/L蔗糖+基础液的解冻液中，每个浓度各停留5 min，再用含20%胎牛血清的DMEM冲洗2次。

1.5自体异位移植A、B组于大鼠左侧后肢做一长0.8 cm纵切口，将新鲜或冻融卵巢组织块移植于肌肉中，常规缝合，术后对手术切口进行聚维酮碘消毒，肌内注射青霉素，2/d，连续用药7 d。

1.6移植后大鼠情况及移植物的取出卵巢组织移植6周后，开始每日行阴道涂片，显微镜下观察脱落细胞类型，出现动情周期的大鼠依据阴道上皮类型进行判定，未出现动情周期的大鼠观察角化细胞，角化细胞比例>50%则认为有雌激素样效应。断头法处死大鼠，取血测定血清雌二醇(E2)水平，手术剥除移植物。

1.7观察指标及检测方法

1.7.1E2水平测定：用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠血清中的E2水平。

1.7.2组织形态学及卵泡密度观察：观察卵巢组织结构及卵泡的形态；随机选取5个视野，用5 mm×5 mm网格微尺计数，计算每平方毫米内卵泡的数量，即卵泡密度。

1.7.3增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达情况：阳性细胞定位于卵母细胞及颗粒细胞核，呈棕黄色。卵母细胞核及>50%的颗粒细胞出现棕色时，视为PCNA蛋白表达阳性。计算PCNA蛋白表达率。PCNA阳性卵泡率=(PCNA阳性卵泡个数/卵泡总个数)×100%。

2结果

2.1移植卵巢组织的存活情况大鼠卵巢组织移植后，存活的卵巢组织均清晰可见，表面红润，呈球形或椭圆形，周围可见血管供应；移植失败的卵巢组织呈纤维化状态，黄白色，周围组织血供不明显，见图1。A、B组分别移植成功13、5只大鼠，存活率分别为65%、25%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2卵泡形态和密度卵巢组织移植后可见大量原始卵泡及窦状卵泡，间质可见大量新生血管。A、B和D组卵巢组织中卵泡密度分别为(5.17±0.47)、(2.07±0.28)和(7.75±0.38)个/mm3，3组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3血清E2水平A、B、C和D组移植后动情期血清E2水平分别为(59.61±6.85)、(28.38±8.47)、(2.59±1.19)和(79.56±12.07)ng/L，A、B组均高于C组，低于D组，且A组高于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4卵巢组织中PCNA表达水平A、B和D组卵泡PCNA阳性表达率分别为(76.24±2.59)%、(40.7±2.86)%和(87.47±3.27)%，3组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠移植卵巢组织中PCNA表达情况见图3。

图1卵巢组织移植后的子宫及移植物的存活情况(黑箭头为子宫，白箭头为卵巢组织)A.纤维化的黄色卵巢组织，子宫萎缩；B.卵巢组织存活，表面可见卵泡发育，子宫饱满

图2卵巢组织移植后卵泡形态(HE×400)A.新鲜移植组；B.直接覆盖玻璃化冷冻组

图3移植后卵巢组织增殖细胞核抗原表达情况(PCNA×200)A.新鲜移植组；B.直接覆盖玻璃化冷冻组

3讨论

移植冻融卵巢组织的首要前提是卵巢组织冷冻成功。冷冻时，卵巢组织可能发生各种冷冻损伤，冰晶形成是最主要的损伤，玻璃化冷冻技术避免了冰晶的形成。本研究采用的DCV技术是对常规玻璃化冷冻方法的改良，是采用玻璃化冷冻方法对卵巢组织进行预处理，然后直接用液氮覆盖在预处理的卵巢组织，之后再进行冷冻保存的方法，因为卵巢组织与液氮直接接触，降温速度更快，卵泡损伤减少，冷冻效率更高，本方法最早由Chen等[4]报道。之后又有学者利用此方法对卵巢组织冷冻进行了研究，发现此方法比传统的玻璃化冷冻更有利于保存卵巢组织[5]。但是由于卵巢组织结构复杂，含有多种不同类型的细胞，每种细胞对冷冻条件要求不同，而且冷冻保护剂都有一定毒性，因此冷冻过程会导致部分卵泡损伤、丢失。本研究结果显示，B组卵巢组织的存活率较A组低也证明了这一点。2004年，Donnez等[6]首次报道了采用程序冷冻方法保存的卵巢组织在解冻后经自体原位移植，患者最终成功分娩一名女婴。Klocke等[7]研究结果表明，程序化冷冻和玻璃化冷冻方法在卵泡存活和卵巢组织形态学方面没有明显差异。程序化慢速冷冻方法成熟，但由于操作复杂、仪器昂贵、需要大量的液氮，冷冻时很难避免冰晶的形成，对细胞和细胞间连接都有不同程度损伤。大量冰晶在冻融时还会产生冻融效应，再次造成对细胞核、细胞连接的损伤，因此在许多生殖中心实际应用中已广泛被玻璃化冷冻替代。

移植物的体积也会影响冷冻和移植效果。参考以前研究者的方法[8-9]，本研究采用的是厚度小、面积大的小体积方法进行卵巢组织冷冻和移植。其优势有以下几方面：①表面积大、厚度薄利于CPA的渗透，能使卵巢组织内细胞迅速脱水而达到“玻璃化”状态，保证了冷冻效果，能更好保存各级卵泡。②薄的组织块移植后与周围组织有更大的接触面积，有利于移植物重新建立血供，减少了移植后因缺血而导致的再灌注损伤。③本研究将卵巢组织移植于大鼠下肢肌肉中，此部位血运较丰富，有利于移植物存活，而且Dath等[10]和Soleimani等[11]的研究也证实了这一点。本研究结果显示，A组及B组血清E2水平高于C组，提示手术摘除卵巢组织彻底，无残留卵巢组织，新鲜及冻融的卵巢组织经移植后都有卵泡存活，并具备一定的内分泌功能。而B组各项指标均低于A组，可能是由于冻融过程中损失一定的卵泡，这与目前的研究[12-14]是一致的。因此，探索更合理的卵巢组织冷冻方案，最大程度减少冷冻副损伤、降低卵泡丢失率，提高移植存活效果，是今后的工作难点和重点。

迄今，全世界已经有10余例通过移植冷冻的卵巢组织获得妊娠的患者，虽然这些学者应用的卵巢组织冷冻方案各不相同，但是，这些案例给了我们很大的鼓舞，尤其最近Dittrich等[15]的报道对卵巢冷冻移植的20例肿瘤患者进行统计，其中19例卵巢功能得到恢复，7例妊娠，4例生育健康婴儿。相信随着研究的深入，将为更多需要冷冻卵巢组织保存生育力的患者带来希望。

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(收稿时间：2015-01-17修回时间：2015-03-03)

女性生育力保存技术专题研究

·论著·

A Study on the Heterotopic Autotransplantation Transplantation with Ovarian Tissues after Cryopreserved Thawed in Rats

LI Dong-xiu, GENG Yang-liu, WU Xiao-hua, YU Xiao-hui, ZHANG Min, XU Qing-hua (Center of Reproductive Medicine, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of direct cover vitrification (DCV) method in freezing ovarian tissues and to analyze the viability and endocrinic function after the autologous heterotopic transplantation in rats. MethodsA total of 50 mature female rats were randomly divided into group A (n=20), group B (n=20), group C (n=5) and group D (n=5). Group A was transplanted with fresh tissues; group B was transplanted with cryopreserred thawed tissues after being cryopreserved for 2 weeks by DCV method; the bilateral ovarian tissues in group C were cut off, and group D underwent sham operations. After autologous heterotopic transplantation for 6 weeks, serum estradiol (E2) levels were detected, and values of follicular density were calculated; histomorphology changes of transplanted ovaries and expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were observed. ResultsThe vascularity was found in surrounding tissues of survival ovaries, while fibering and unconspicuous vascularity were found in unsuccessfully transplanted ovary tissues. The survival rate of grafts in group B was lower than that in group A (P<0.05). The value of follicular density in group B was lower than those in group A and D, and the value in group A was lower than that in group D (P<0.05). The serum E2levels in group A and B were higher than that in group C, but the values were lower than that in group D (P<0.05). The positive rates of PCNA in group A and B were lower than that in group D, and the rate in group B was lower than that in group A (P<0.05). ConclusionSome ovarian tissues with autologous heterotopic transplantation after DCV and resuscitation method can survive and rehabilitate cover endocrine function.

[Key words]Ovary； Vitrification； Cryopreservation； Graft survival； Transplantation, autologous； Rats, Wistar

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.002

[文献标志码][中国图书资料分类号]R715；R-332A

[文章编号]2095-140X(2015)05-0006-03

[通讯作者]吴小华，E-mail：xiaohuawu65@sohu.com

[基金项目][作者单位]050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院生殖医学中心