低浓度他克莫司与抗真菌药物联合的体外抗真菌效应

陈淳陈启红孙毅高露娟曾同祥（．湖北省荆州市中心医院皮肤病与性病科，荆州43400；．上海市复旦大学附属中山医院皮肤科，上海0003）

低浓度他克莫司与抗真菌药物联合的体外抗真菌效应

陈淳1陈启红1孙毅1高露娟2曾同祥1
（1．湖北省荆州市中心医院皮肤病与性病科，荆州434100；2．上海市复旦大学附属中山医院皮肤科，上海200032）

【摘要】目的 测定他克莫司（FK⁃5066）与抗真菌药物对浅部致病真菌的联合效应。方法 参考CLSI的M27⁃A3和M38⁃A2方案分别测定酮康唑对念珠菌、特比萘芬对皮肤癣菌的最低抑菌浓度（MIC）；利用棋盘法，测定他克莫司与酮康唑或特比萘芬的联合抗真菌效果。结果 酮康唑单独对念珠菌MIC50和MIC90分别为：4 μg／mL和8 μg／mL；与他克莫司联合应用时，对53．3%的菌株有联合效应（n＝15），对其余菌株无协同效应。特比萘芬单独对皮肤癣菌MIC50和MIC90分别为：0．06 μg／mL和0．125 μg／mL；与他克莫司联合应用时，对46．7%菌株（n＝15）有协同效应，对其余菌株表现为无关。结论 低浓度他克莫司在体外与抗真菌药物联合应用时，能够降低药物对部分菌株的MIC，未发现拮抗效应。

【关键词】念珠菌；他克莫司；皮肤癣菌；抗真菌；体外药敏试验

In vitro antifungal activity of tacrolimus combined with antifungals against Candida spp．and dermatophytes

CHEN Chun1，CHEN Qi⁃hong1，SUN Yi1，GAO Lu⁃juan2，ZENG Tong⁃xiang1

（1．Department of Dermatology and Venereology，Jingzhou Central Hospital，Jingzhou 434100，China；2．Department of Dermatology，Zhongshan Hospital Fudan University，Shanghai，200032，China）

【Abstract】Objectives To investigate the in vitro antifungal susceptibility of FK⁃506 combined with antifungals to Candida spp．and dermatophytes．Methods The minimal inhibitory concentrations（MICs）of Candida spp．against ketoconazole and dermatophytes against terbinafine were assayed using CLSI M27⁃A3 and M38⁃A2 microdilution method，respectively．By using broth microdilution checkerboard technique system，we evaluated the combined antifungal activity of tacrolimus with ketoconazole or terbinafine against Candida spp．and dermatophytes，respectively．Results The MIC50and MIC90of ketoconazole against Candida spp．were 4 μg／mL and 8 μg／mL，respectively．The MIC50and MIC90of terbinafine against dermatophytes were 0．06 μg／mL and 0．125 μg／mL，respectively．The result showed that the combination of tacrolimus and Ketoconazole or Terbinafine had synergistic inhibitory activity against Can⁃dida spp．（53．5%，n＝15）and dermatophytes（46．7%，n＝15）．Conclusion The MICs of antifungals can be reduced partly when combined with low concentration of FK⁃506 against Candida spp．and dermatophytes，and no antagonism was found．

【Key word】 Candida spp．；Tacrolimus（FK⁃506）；dermatophytes；antifungl；in vitro susceptibility

［Chin J Mycol，2015，10（4）：207⁃209］

浅部真菌病是指真菌感染皮肤角质层、表皮及附属器而引起的真菌病，主要由皮肤癣菌和念珠菌等感染引起，是十分常见的真菌感染性疾病［1⁃2］。近年来，其发病率不断增多，严重影响人们的身心健康和生活质量。手足癣及体癣主要由皮肤癣菌属的须癣毛癣菌和红色毛癣菌引起［2］，而间擦疹和黏膜部位的感染则多由念珠菌感染引起［3］。

浅部真菌病的外用药物主要是含有抗真菌药物的乳膏或者搽剂，如酮康唑、联苯苄唑和特比萘芬等。联合少量的糖皮质激素如曲安奈德能够较快改善患者症状，加快炎症的消退而且不影响抗真菌药物的疗效［3］。然而由于激素色素沉着、皮下脂肪萎缩等的副作用，限制了其临床的应用［4］。他克莫司乳膏是近年来皮肤科临床上使用较广泛的一种非激素的外用抗炎药，由于其具有良好的抗炎效果，被广泛用于皮肤科炎症性疾病的治疗，包括特应性皮炎、银屑病和过敏性接触性皮炎等。他克莫司对人体胶原合成无抑制作用，不会引起皮肤萎缩，局部外用安全性高、耐受性好，因而可用于面部、生殖器和间擦部等薄嫩部位皮肤［5］。

为开发新型浅部真菌感染的治疗组合，以便为临床疗效提高提供理论基础，我们参照美国临床实验室标准化研究所（Clinical Laboratory Standard In⁃stitute，CLSI）颁布的M27⁃A3和M38⁃A2方案［6⁃7］，以微量液基稀释法分别测定15株念珠菌临床株对酮康唑和15株皮肤癣菌临床株对特比萘芬的体外药物敏感性；同时，我们尝试联合他克莫司与该两种抗真菌药物，观察菌株MIC的变化。研究旨在为改善临床浅部真菌病的治疗提供一定的帮助，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1．1实验菌株

30株临床分离株均保藏于荆州市中心医院皮肤科真菌实验室。15株念珠菌均经过CHROMagar显示培养基和API⁃20C⁃AUX进行鉴定，包括8株白念珠菌，4株热带念珠菌和3株近平滑念珠菌。皮肤癣菌进行了形态学和分子学鉴定，包括10株红色毛癣菌和5株须癣毛癣菌。所有菌株试验前均在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面上活化（30℃，7 d），以保证受试真菌的活力与纯度。

1．2抗真菌药物

酮康唑（Sigma Chemical Co，St．Louis，批号：456136），特比萘芬（Sigma Chemical Co，St．Louis，批号：T8826）和他克莫司（Sigma Chemical Co，St．Louis，批号：F4679）。将药物以分析纯度的DMSO溶解成储存液，浓度均为1 600 μg／mL。

1．3微量液基稀释法

参考CLSI M27⁃A3和M38⁃A2方案［6⁃7］，应用经三氮吗啡啉丙磺酸钠（MOPS）缓冲（pH＝7．0）的RPMI 1640液体培养基，过滤灭菌。用无菌生理盐水收集孢子，以血细胞计数板调整孢子量均为（1～3）×106CFU／mL；然后以RPMI 1640液体培养基进一步稀释1 000倍，致接种终浓度为（1～3）× 103CFU／mL；特比萘芬的浓度为2～0．003 μg／mL，酮康唑为16～0．03 μg／mL；他克莫司的浓度为16～0．03 μg／mL；同时设立生长对照（无药物孔）和阴性对照（无菌孔）；分别于35℃孵育48 h（念珠菌）和4 d（皮肤癣菌）。肉眼观察判读结果，酮康唑对念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）定义为肉眼观察到的与生长对照相比50%抑制的最低药物浓度。特比萘芬对皮肤癣菌的MIC则定义为肉眼观察到的与生长对照相比80%抑制的最低药物浓度。所有药敏试验均重复操作2遍。药敏质控菌株为ATCC22019。通过每种药物对不同菌株的MIC值求出能够抑制50%菌株的MIC值（MIC50）和抑制90%菌株的MIC值（MIC90）。

1．4联合体外药物敏感性

药物联合采用棋盘法，即在96孔板中分别加入不同浓度的两种药物，同时设立生长对照和空白对照。特比萘芬的浓度为2～0．003 μg／mL，酮康唑为16～0．03 μg／mL，他克莫司的浓度为16～0．03 μg／mL。接种时除阴性对照外其余各孔均加入100 μL的2倍终浓度的菌悬液，35℃孵育48～96 h后观察结果。所有药敏试验均重复操作2次。分数抑菌浓度（FIC）的判定：与生长对照孔相比，生长100%抑制所对应的最低药物浓度，包括各药物单独和联合时的MIC值。联合用药时各药物的MIC值分别除以单独用药时MIC值的商的和，即分数抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration in⁃dex，FICI）＝MIC A联合／MIC A单独＋MIC B联合／MIC B单独。相互作用解释为：FICI＜0．5为协同作用，0．5＜FICI≤4为无关，FICI＞4为拮抗。

2　结 果

酮康唑对念珠菌MIC范围为2～8 μg／mL；特比萘芬对皮肤癣菌的MIC范围为0．06～0．5 μg／mL；酮康唑单独对念珠菌MIC50和MIC90分别为4 μg／mL和8 μg／mL；特比萘芬单独对皮肤癣菌MIC50和MIC90分别为0．06 μg／mL和0．125 μg／mL。酮康唑与他克莫司联合应用时，对53．3%菌株（8／15）有联合效应，对其余菌株无协同效应（见表1）。特比萘芬与他克莫司联合应用时，对46．7%菌株（7／15）由协同效应，对其余菌株表现为无关（见表2）。

3　讨 论

他克莫司（FK⁃506），是1984年从非致病真菌中提取的大环内酯类免疫抑制剂。他克莫司和环孢素A相比，其分子量较小，但免疫活性是环孢素A的10～100倍，该药最早用于器官移植后的免疫抑制治疗。他克莫司软膏是首个开发成功的外用免疫调节剂，有效且安全，在皮肤科的应用越来越广泛［5］。酮康唑作为作为常用的唑类抗真菌药物，广泛用于念珠菌病的治疗。特比萘芬通过抑制真菌细胞膜的合成发挥杀真菌的作用，体内、外都有非常好的抗皮肤癣菌作用［3］。通过微量液基稀释法，我们观察到酮康唑对念珠菌MIC范围为2～8 μg／mL；特比萘芬对皮肤癣菌的MIC范围为0．06～0．5 μg／mL，他克莫司对所有菌株的MIC均≥16 μg／mL。

表1　酮康唑单独和联合他克莫司对念珠菌体外抗真菌药物敏感性Tab．1 In vitro antifungal susceptibility of FK⁃506 combined with ke⁃toconazole to Candida spp．

然而，我们发现部分菌株在他克莫司存在的情况下，对抗真菌药敏的敏感性有一定的增加。他克莫司发挥作用于钙离子依赖的信号传导途径，使钙调磷酸酶失活，从而抑制依赖活化T细胞核因子的细胞因子基因的转录［5］。而钙调磷酸酶对于真菌胞壁的完整性、毒力及真菌对抗真菌药物耐受都具有重要作用。文献报道他克莫司与卡泊芬净、伊曲康唑、伏立康唑在体外有联合抗白念珠菌作用［8⁃9］。此外，当他克莫司与伊曲康唑、泊沙康唑联合抗米根霉时，其对唑类药物的敏感性明显增高，并且从抑菌作用变为杀菌作用，这种机制可能与他克莫司诱导凋亡有关［10］。然而，他克莫司对真菌药物MIC的影响还有待于更进一步的研究。

本研究中他克莫司能够降低抗真菌药物对部分菌株的MIC，并且没有发现任何拮抗作用。实验数据进一步丰富了他克莫司在抗真菌治疗中的研究，能够更好地为临床治疗提供一定的参考，但体外药敏结果与临床药物治疗效果之间的一致性有待进一步的动物实验和临床实践来证实。

表2　特比萘芬单独和联合他克莫司对毛癣菌体外抗真菌药物敏感性Tab．2 In vitro antifungal susceptibility of FK⁃506 combined with ter⁃binafine to Trichophyton

参考文献

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［本文编辑］ 施 慧

·论著·

［收稿日期］2015⁃04⁃11

通讯作者：孙毅，E⁃mail：710514760＠qq．com；高露娟，E⁃mail：gao＿lujuan＠163．com

作者简介：陈淳，女（汉族），本科，主管护师．E⁃mail：64414730＠qq．com

基金项目：国家自然科学基金（81401677，31400131）

【中图分类号】R 978．5

【文献标识码】A

【文章编号】1673⁃3827（2015）10⁃0207⁃03