国内多中心甲真菌病病原菌流行病学调查

王爱平余进万喆李福秋曾敬思刘维达章强强郝飞冉玉平席丽艳赖维李若瑜

（1．北京大学第一医院皮肤性病科，北京100034；2．吉林大学第二医院皮肤科，长春130041；3．华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科，武汉430022；4．中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所真菌科，南京210042；5．复旦大学附属华山医院皮肤科，上海200040；6．第三军医大学第一附属医院皮肤科，重庆400038；7．四川大学华西医院皮肤科，成都610041；8．中山大学孙逸仙纪念医院皮肤科，广州510120；9．中山大学附属第三医院皮肤科，广州510630）

国内多中心甲真菌病病原菌流行病学调查

王爱平1余进1万喆1李福秋2曾敬思3刘维达4章强强5郝飞6冉玉平7席丽艳8赖维9李若瑜1

（1．北京大学第一医院皮肤性病科，北京100034；2．吉林大学第二医院皮肤科，长春130041；3．华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科，武汉430022；4．中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所真菌科，南京210042；5．复旦大学附属华山医院皮肤科，上海200040；6．第三军医大学第一附属医院皮肤科，重庆400038；7．四川大学华西医院皮肤科，成都610041；8．中山大学孙逸仙纪念医院皮肤科，广州510120；9．中山大学附属第三医院皮肤科，广州510630）

【摘要】目的 了解国内甲真菌病病原菌的种类和构成情况，掌握流行病学资料。方法 对真菌镜检阳性的1 428例甲真菌病患者进行真菌培养和临床分析。结果 真菌培养阳性率为53．9%，分离出病原菌800株。其中皮肤癣菌占84．0%，以红色毛癣菌为主（80．9%），其次为指（趾）间毛癣菌和絮状表皮癣菌。酵母菌占11．4%，以念珠菌属为主（10．1%），尤以近平滑念珠菌为主，其次为白念珠菌和热带念珠菌。其他霉菌占4．6%，以枝顶孢霉为主（2．3%），其次曲霉属、青霉属、毛壳菌属、镰刀菌属和帚霉属等。结论 本研究显示甲真菌病病原菌以皮肤癣菌为主，其次为酵母菌和霉菌。

【关键词】甲真菌病；病原菌；多中心；流行病学研究

［Chin J Mycol，2015，10（4）：197⁃202］

甲真菌病是由皮肤癣菌、酵母菌及非皮肤癣菌霉菌引起的甲板和甲下组织感染。为了解甲真菌病中各病原菌所占的比例，以便指导临床医生更好的对甲真菌病患者进行防治。我们于2010年11月～2011年10月对甲真菌病病原菌进行流行病学多中心调查，参与单位分别位于长春、北京、武汉、南京、上海、成都、重庆、广州，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1．1病例选择

来自上述研究单位经临床诊断和真菌镜检确诊的甲真菌病患者，获取知情同意书。

1．2观察项目

采集入选病例的人口学资料，包括出生年月日、性别、病程、合并的基础疾病（包括糖尿病、高血压、冠心病、自身免疫病等）、既往真菌病史（包括头癣、体癣、股癣、手癣、甲真菌病、花斑糠疹等）、既往口服抗真菌药物史（包括三唑类、丙烯胺类等）、外用抗真菌药物史（包括咪唑类、丙烯胺类、吗啉类、环吡酮胺等）、甲真菌病的临床分型［包括浅表白色型（SWO）、远端侧位甲下型（DLSO）、近端甲下型（PSO）、全甲破坏型（DSO）、甲内型（EO）、甲沟炎］、病甲位置。以不低于300万像素的照相机拍照记录病甲的临床表现、真菌镜检和真菌培养情况。

1．3真菌镜检

采集标本前用75%酒精彻底清洁病甲，以提高镜检的阳性率，减少培养时的细菌污染。钝刀或取甲剪用火焰灭菌，冷却后从甲变色、萎缩或变脆的部位、健甲与病甲的交界处取材，保证一定深度，标本的量应足够大，可多甲取材。SWO：自病甲表面的白色斑点处刮取尽可能多的甲屑。DLSO：应尽可能自健甲与病甲交界处刮屑，必要时剪去远端的病甲。DSO：取材应包括全甲厚度，部分真菌限于甲板下方，如果甲板增厚，应从其下方刮屑。PSO 和EO：取材有一定难度，可用甲钻或解剖刀从甲表面病变处深刮取尽可能多的甲屑。甲沟炎：拭子取材，一般可不用灭菌水或生理盐水浸湿。

取材尽量采用钝刀，刮片比拭子更好，但拭子更易于标本的运送。将上述标本置于载玻片上，加一滴10%～20%KOH溶液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使之沸腾，以免结晶。然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉签吸去周围溢液，置显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和（或）孢子，然后用高倍镜证实，并观察菌丝和孢子的形态、特征、位置、大小和排列等。如果真菌镜检阳性，同时进行真菌培养。对于不能及时进行上述检查时，可将病甲标本收集到黑纸中（约10 cm× 10 cm）并做好详细标记，于室温干燥保存。对于甲沟炎患者至少应取两个拭子，放入无菌试管中放置在4℃冰箱中保存。

1．4真菌培养

所有真菌镜检阳性的患者需要进行真菌培养，本研究采用多点接种平皿培养法，采用含有和不含有放线菌酮两种培养基培养。A平皿：葡萄糖蛋白胨琼脂，添加氯霉素50 mg／L。B平皿：葡萄糖蛋白胨琼脂，添加氯霉素50 mg／L，放线菌酮500 mg／L。将样本以75%酒精稍浸泡后，分别多点接种（7～10个点）在A、B两个平皿上。27℃，培养4周。如两平皿中相同菌落数≥4个时可判断为有意义的致病菌。如果真菌培养阳性，进行菌种鉴定。

丝状型菌落鉴定：可用镊子夹1～1．5 cm长的透明胶带，轻压菌落中央的成熟区，再把胶带粘到已放有乳酸酚棉兰染色液的玻片上，先固定胶带游离端，再缓慢让胶带与染液接触（尽量排空气泡），染色10～20 min；用滤纸轻压胶带，吸除多余染液后进行显微镜下检查。根据菌落形态、质地、颜色和显微镜下结构，初步判断属种。必要时进行小培养、特殊培养基培养、生理生化试验及分子生物学方法进行菌种鉴定。

酵母和酵母样型菌落鉴定：先用念珠菌显色培养基35℃培养48 h，根据菌落颜色鉴定白念珠菌（翠绿色菌落）、热带念珠菌（铁蓝色菌落）、光滑念珠菌（紫色菌落）和克柔念珠菌（淡粉红色菌落）。不能用念珠菌显色培养基鉴定的菌株用沙堡培养基30℃培养48 h并分离纯化，再用API20C AUX进一步鉴定，仍不能鉴定的菌株报告为酵母菌，必要时行分子生物学鉴定。

对确定为甲真菌病的致病菌菌株需要转种在试管培养基中进行保存，定期收集菌种送往北京大学真菌和真菌病研究中心进行菌种复核鉴定。

1．5数据处理及统计学分析

本研究应用SAS 9．2版进行统计学分析。采用描述性统计对所有数据进行分析。针对计量资料，描述其均数、标准差、有效例数、中位数、最大值和最小值，并计算均数的95%可信区间；针对计数资料，描述其频数和百分比，并计算该百分比的95%可信区间。

2　结 果

2．1一般资料

解释：利用上述数学结构，我们可以看出，函数差距最大值的最小值应该位于最大值减去最小值的一半位置处。自然而然为

本研究共纳入有效病例1 428例，其中男625例（43．8%），女803例（56．2%）；平均年龄（41．26 ±16．47）岁，中位数38．81岁。平均病程（6．12±6．89）a，中位数4 a，其中病程＜1 a的184例（12．9%）；1～5 a的597例（41．9%）；5～10 a的283例（19．9%）；10～20 a的246例（17．3%）；＞20 a的114例（8%）。结果显示多数就诊患者（41．9%）的病程在1～5 a。真菌培养阳性770例，阳性率53．9%（范围10．9%～74．9%）。

在真菌培养阳性的770例患者中，记录病甲临床类型1 024例次，甲真菌病临床类型分布及与病原菌相关性见表1。结果显示甲真菌病最主要的临床类型一半为DLSO，其次为DSO和SWO，各病原菌所致临床类型分布差异不明显。

表1　甲真菌病临床类型分布及与病原菌的相关性（n，%）Tab．1 Distribution of Onychomycosis clinical type and the relevance to the pathogen

在真菌培养阳性的770例患者中，共计病甲3 888个，其中趾甲3 118个，指甲770个，趾甲患病率明显高于指甲；而拇指趾甲的罹患率高于其他指趾甲；皮肤癣菌指甲占77．8%（599／770），趾甲占88．6%（2 762／3 118），酵母菌分别为18．6%（143／770）和7．0%（219／3118），霉菌分别为3．6%（28／770）和4．4%（137／3 118）。甲真菌病病甲分布及与病原菌的相关性见表2。

有261例（18．3%）患者合并至少一种基础疾病，其中罹患高血压患者最多，有131例次；糖尿病48例次；冠心病33例次，其他71例次。

既往病史最多的三种真菌病依次为足癣792例次、甲真菌病328例次、手癣186例次、股癣42例次、体癣36例次、花斑糠疹2例次，其他真菌病4例次。既往使用唑类抗真菌药物有377例次；使用丙烯胺类药物36例次，其他药物458例次。

2．2甲真菌病病原菌分离情况

真菌培养阳性的770例患者中，真菌镜检显示为菌丝的占99．1%，其中皮肤癣菌为99．6%，酵母菌为95．5%，霉菌为97．2%。真菌镜检显示为孢子／芽孢的占12．7%，其中皮肤癣菌为12．1%，酵母菌为19．3%，霉菌为11．1%。培养出单一真菌的占96．2%（741／770），培养出2种（28例）和3种真菌（1例）的占3．8%（29／770）。共分离出病原菌800株，其中皮肤癣菌672株（84．0%），酵母菌91株（11．4%），其他霉菌37株（4．6%）。病原菌分离菌株情况见表3～5。

甲真菌病病原菌地域分布显示长春地区皮肤癣菌为55．4%，酵母菌为42．9%，其他霉菌为1．8%。北京地区分别为94．4%、2．2%和3．4%，其中1例患者为红色毛癣菌和指（趾）间毛癣菌混合感染。武汉地区分别为91．2%，7．0%和1．8%，其中有1例为酵母菌和皮肤癣菌混合感染。南京地区分别为91．0%，4．2%和4．8%，其中1例患者为红色毛癣菌和白念珠菌混合感染。

3　讨 论

本研究共纳入有效病例1 428例，43．8%为男性，56．2%为女性，年龄中位数为38．81岁，病程中位数为4 a，41．9%的患者病程在1～5 a。甲真菌病临床类型以DLSO为主，其次为DSO、SWO、PSO、EO、甲沟炎。趾甲患病率明显高于指甲，拇指趾甲的罹患率高于其他指趾甲。

表2　甲真菌病病甲分布及与病原菌的相关性（n，%）Tab．2 Distribution of onychomycosis affecting nail and the relevance to the pathogen

表3　672株皮肤癣菌分离情况Tab．3 Distribution of 672 strains of dermatophytes isolates

表4　91株酵母菌分离情况Tab．4 Distribution of 91 strains of yeasts isolates

表5　37株非皮肤癣菌霉菌分离情况Tab．5 Distribution of 37 strains of non⁃dermatophytes moulds isolates

一直以来认为真菌培养为甲真菌病诊断的金标准，但最近有学者指出直接镜检由于阳性率高、快速、经济，更适于辅助临床诊断［1］。本研究显示甲真菌病真菌镜检显示为菌丝的占99．1%，显示为孢子／芽孢的占12．7%。1 428例患者中仅有770例患者真菌培养阳性，阳性率为53．9%，范围10．9%～74．9%。文献报道甲真菌病的培养阳性率为25%～80%［1］，此研究与文献报道相一致。其中真菌培养为单一真菌感染的占96．2%，混合感染为3．8%。

图1　红色毛癣菌：a．临床表现；b．直接镜检：分支分隔菌丝；c．真菌培养：在含有和不含有放线菌酮的两种培养基上多点接种显示同一种菌落生长 图2 指（趾）间毛癣菌：a．临床表现；b．直接镜检：分支分隔菌丝；c．真菌培养：多点接种显示同一种菌落生长 图3 红色毛癣菌与指（趾）间毛癣菌混合：a．临床表现；b．直接镜检：关节孢子；c．真菌培养：在两种培养基上多点接种均显示两种不同表型的菌落生长 图4 近平滑念珠菌：a．临床表现；b．直接镜检：假菌丝；c．真菌培养：多点接种显示同一种菌落生长 图5 毛壳菌属：a．临床表现；b．直接镜检：菌丝；c．真菌培养：在两种培养基上多点接种显示同一种菌落生长 图6 镰刀菌属：a．临床表现；b．真菌培养：在两种培养基上多点接种显示同一种菌落生长Fig．1 T．rubrum：a．Clinical manifestations；b．Direct microscopic examination：branching septate hyphae；c．Cultures：multipoint inoculation revealed the same colony in duplicate plates with and without cycloheximide（actidione） Fig．2 T．interdigitale：a．Clinical manifestations；b．Direct micro⁃scopic examination：branching septate hyphae；c．Cultures：multipoint inoculation revealed the same colony in medium Fig．3 T．rubrum＆T．inter⁃digitale：a．Clinical manifestations；b．Direct microscopic examination：arthrospores；c．Cultures：multipoint inoculation revealed two types of colonies in two mediums Fig．4 C．parapsilosis：a．Clinical manifestations；b．Direct microscopic examination：pseudohyphae；c．Cultures：multipoint inoculation revealed the same colony in medium Fig．5 Chaetomium： a．Clinical manifestations；b．Direct microscopic examination：hyphae；c．Cultures：multi⁃point inoculation revealed the same colony in two mediums Fig．6 Fusarium：a．Clinical manifestations；b．Cultures：multipoint inoculation revealed the same colony in two mediums

770例患者中分离出病原菌800株，其中皮肤癣菌占84．0%，以红色毛癣菌为主（80．9%）（见图1），其次为指（趾）间毛癣菌（见图2）和絮状表皮癣菌。有时可见混合感染（见图3）。酵母菌占11．4%，以念珠菌属为主（10．1%），尤以近平滑念珠菌为主（见图4），其次为白念珠菌和热带念珠菌。其他霉菌占4．6%，以枝顶孢霉为主（2．3%），其次曲霉属、青霉属、毛壳菌属（见图5）、镰刀菌属（见图6）和帚霉属等。趾甲真菌病以皮肤癣菌为优势菌，指甲真菌病以酵母菌为优势菌。

本次甲真菌病病原菌流行病学调查选择了全国9家医院，所在地代表了我国东北、华北、华中、华东、西南、东南，覆盖地理范围较广，试验设计较为严格，培养方法及判定标准统一，所获得的研究结果基本上可以客观反映我国甲真菌病病原菌的流行病学情况。余进等［2］曾在2006年就国内甲真菌病病原菌的流行病学调查进行综述，国内曾先后两次组织多中心、统一培养方法及判定标准进行甲真菌病病原菌流行病学调查。在2002年5月～2003年11月参与调查单位分别位于北京、武汉、南京、上海、成都、广州。在739株病原菌中皮肤癣菌占67．5%，酵母菌28．1%，其他霉菌4．3%。在2004～2005年参与的单位分别位于长春、北京、西安、武汉、广州，共1 418例患者，结果显示皮肤癣菌占67．9%，酵母菌18．0%，其他霉菌12．6%，混合感染1．5%。本次研究结果显示甲真菌病的病原菌皮肤癣菌居首位为84%，其次为酵母菌11．4%和非皮肤癣菌霉菌4．6%，混合感染为3．8%，与国内外文献报道结果基本一致。且北京、武汉和上海地区病原菌分布一致。

皮肤癣菌中红色毛癣菌是引起甲真菌病的最主要的病原菌，其次为指（趾）间毛癣菌，随着分子生物学的发展，对须癣毛癣菌进行了重新分类，临床上常见的须癣毛癣菌被准确定义为指（趾）间毛癣菌（Trichophyton interdigitale），目前应该使用这个名称。而真正的须癣毛癣菌为亲动物性，很少感染人类，主要引起鼠或骆驼感染［3⁃4］。小孢子菌属很少感染甲，本文中有1例犬小孢子菌感染报道，是否与家养宠物有关不得而知，国内外均有少数小孢子菌属菌种感染甲板的文献报道［4］。目前文献报道的引起甲癣的皮肤癣菌共有18种，其中毛癣菌属11种、小孢子菌属6种、表皮癣菌属1种。红色毛癣菌、指（趾）间毛癣菌、絮状表皮癣菌仍是国内外大部分地区最常见的引起甲癣的三种皮肤癣菌［5］。

念珠菌性甲真菌病在甲真菌病中所占的比重世界各地相差很大（9%～82%），地理环境不同，发病率不同，或与气候相关，或与其他特殊情况相关，如女性比男性更为常见，指甲比趾甲更为常见［6］。既往研究显示在我国随着地理位置南移，在甲真菌病中皮肤癣菌尽管仍是主要致病菌，但其所占比例有所下降，酵母菌比例有所上升［2］。念珠菌性甲真菌病的病原菌主要包括白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、热带念珠菌等，白念珠菌和近平滑念珠菌最常见［6］。本研究显示念珠菌属占10．1%，以近平滑念珠菌和白念珠菌为主，与文献报道一致。

甲霉菌感染在英国的发病率约5%，可见于各种年龄，但最多见于50岁以上的患者，男性多于女性，趾甲多于指甲。致病菌因地区和名族不同，如短帚霉是英国最常见的霉菌感染源。柱顶孢霉也可从热带地区患者的病甲中分离出。其他引起甲感染的霉菌包括曲霉属、枝顶孢霉、镰刀菌属等［7］。本研究显示霉菌占4．6%，以枝顶孢霉为主，其次曲霉属、青霉属、毛壳菌属、镰刀菌属和帚霉属等，与文献报道相一致。

综上所述，目前国内甲真菌病病原菌分布以皮肤癣菌最为多见，其次为酵母菌和非皮肤癣菌霉菌。说明甲真菌病感染来源主要是足癣所致，加强足癣的防治对预防甲真菌病的发生尤为重要。

参考文献

［1］ 闫玮，陈伟，胡苏泉，等．南京地区305例甲真菌病临床及致病菌分析［J］．实用皮肤病学杂志，2014，7（1）：13⁃15．

［2］ 余进，李若瑜．国内甲真菌病病原学的流行病学调查［J］．中国真菌学杂志，2006，1（1）：63⁃65．

［3］ 陈柏睿，李若瑜．须癣毛癣菌分类进展［J］．中国真菌学杂志，2011，6（1）：51⁃56．

［4］ de Hoog GS，Guarro J，Gené J，et al．Atlas of Clinical Fungi：The ultimate benchtool for diagnostics［M］．version 4．0（June 2014）．

［5］ 冯姣，曹梅华，陈军，等．甲癣的病原学有进展［J］．中国真菌学杂志，2013，8（2）：120⁃123．

［6］ 夏修蛟，许爱娥．念珠菌性甲真菌病［J］．中国真菌学杂志，2006，1（4）：245⁃247．

［7］ Richardson Malcolm D，Warnock David W．Fungal Infection：Di⁃agnosis and Management［M］．Second edition．USA：Blackwell Science，1997．

［本文编辑］ 卫凤莲

·消息·

Multi⁃center epidemiological survey of pathogenic fungi of onychomycosis in China

WANG Ai⁃ping1，YU Jin1，WAN Zhe1，LI Fu⁃qiu2，ZENG Jing⁃si3，LIU Wei⁃da4，ZHANG Qiang⁃qing5，HAO Fei6，RAN Yu⁃ping7，XI Li⁃yan8，LAI Wei9，LI Ruo⁃yu1
（1．Department of Dermatology＆Venereology，First Hospital，Peking University，Beijing 100034；2．Department of Dermatology，the Sec⁃ond Hospital of Jilin University，Changchun 130041；3．Department of Dermatology＆Venereology，Union Hospital，Tongji Medical Col⁃lege，Huazhong Science and Technology University，Wuhan 430022；4．Department of mycology，Insitute of Dermatology，Chinese Acade⁃my of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Nanjing 210042；5．Department of Dermatology，Huashan Hospital，Fudan U⁃niversity，Shanghai 200040；6．Department of Dermatology and Venereology，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038；7．Department of Dermatology and Venereology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041；8．De⁃partment of Dermatology，the Sun Yat⁃Sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃Sen University，Guangzhou 510120；9．Department of Dermatolo⁃gy，the third Affiliated Hospital of Sun Yat⁃sen University，Guangzhou 510630）

【Abstract】Objective The aim of this study was to investigate the epidemiology of pathogenic fungi of onychomycosis in China．Methods Fungal culture and clinical analysis were performed on 1 428 cases of onychomycosis using positive direct microscopic exam⁃ination．Results Eight hundred strains were isolated，the positive rate was 53．9%．The most frequently isolated fungi were dermatophytes （84%），Trichophyton rubrum accounted for 80．9%，followed by Trichophyton interdigitale and Epidermophyton floccosum．The second was yeasts（11．4%），Candida accounted for 10．1%，mainly included C．parapsilosis，C．albicans and C．tropicalis．Non⁃dermatophytic moulds accounted for 4．6%，included Acremonium，Aspergillus，Penicillium，Chaetomium，Fusarium and Scopulariopsis．Conclusion In China，the most frequently pathogenic fungi of onychomycosis were dermatophytes，followed by yeasts and non⁃dermatophytic moulds．

【Key words】onychomycosis；pathogenic fungi；multicenter；epidemiological survey

［收稿日期］2014⁃12⁃02

通讯作者：李若瑜，E⁃mail：lry0660＠gmail．com

作者简介：王爱平，女（汉族），学士，主任医师．E⁃mail：wangap＠medmail．com．cn

【中图分类号】R 756．4

【文献标识码】A

【文章编号】1673⁃3827（2015）10⁃0197⁃06