球形孢子丝菌DNA提取方法的比较

石滢 崔岩 赵莉佩 宋洋 李珊山（吉林大学第一医院皮肤性病科，长春130021）

球形孢子丝菌DNA提取方法的比较

石滢 崔岩 赵莉佩 宋洋 李珊山
（吉林大学第一医院皮肤性病科，长春130021）

【摘要】目的 获得一种高效、快速、简便的提取球形孢子丝菌DNA的方法。方法 以不同地区来源的球形孢子丝菌为实验材料，采用CTAB法、异硫氰酸胍法、试剂盒法、碱裂解法4种方法分别提取球形孢子丝菌DNA。通过紫外吸光度法测定DNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增评价DNA的质量。结果 虽然不同方法均可得到球形孢子丝菌的DNA，但碱裂解法获得DNA的浓度和纯度明显优于其他3种方法。利用钙调蛋白基因的引物对DNA进行PCR扩增后，各样本均出现阳性条带，且条带亮度较好。结论 碱裂解法是获得高质量球形孢子丝菌DNA的理想方法。

【关键词】球形孢子丝菌；碱裂解法；CTAB法；异硫氰酸胍法；DNA提取

［Chin J Mycol，2015，10（4）：216⁃219］

孢子丝菌病（Sporotrichosis）是由孢子丝菌（Sporothrix spp．）引起的人畜共患的深部真菌病。新的分类鉴定法已将孢子丝菌分为由S．schenckii sensu stricto，S．globosa，S．brasiliensis，S．mexicana，S．Luriei，S．pallida等组成的复合体［1⁃2］，其中球形孢子丝菌（S．globosa）为我国孢子丝菌病的主要致病菌［3⁃4］。在以往基因分型的相关研究中，孢子丝菌病的型别、皮损表现及菌株的药物敏感性、地域来源等，尚无定论［5⁃6］。但随着分类的细化及AFLP、 DGGE等基因分型技术的出现，为解决上述问题提供了新的思路。但获得高质量的DNA是进行基因扩增或基因分型的前提。本文通过比较真菌DNA几种常见的提取方法，筛选出一种可以获得高质量球形孢子丝菌DNA的方法，为开展球形孢子丝菌的相关分子实验提供技术支持。

1　材料与方法

1．1菌株来源

分别取自吉林省（FHJU 1）、江苏省（WHSU 4）、广州省（SHZU 2）、重庆市（CQMU 1）、北京市（FHPU 3），共5株球形孢子丝菌（S．globosa），菌株由吉林大学第一医院皮肤性病科保存并提供。

1．2主要试剂

CTAB、异硫氰酸胍购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司，酵母基因组DNA提取试剂盒（DP307）、2×Taq PCR MasterMix和DL2000购于北京天根生化科技有限公司，上游引物（CL1：5’⁃GARTWCA AGGCCTTCTC⁃3’）和下游引物（CL2A：5’⁃TTTTTGCATGAGTTGG AC⁃3’）由上海生工生物技术有限公司合成。

1．3菌株的培养与收集

挑取不同地区的球形孢子丝菌接种至PDA斜面培养基，于28℃活化7 d后，转种至PDB液体培养基，于28℃振荡培养72 h。取2 mL菌悬液，12 000 r／min离心15 min，收集菌体，用无菌水洗涤2次。

1．4DNA提取的方法

CTAB法［7⁃8］加入600 μL CTAB提取液（2% CTAB，100mM Tris，1．4M NaCl，20mM EDTA）及1%巯基乙醇，混匀，55℃水浴60 min，12 000 r／min离心5 min，收集上清液；然后加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混匀后，12 000 r／min离心2 min，收集上清；加入1／10体积3M醋酸钠，2倍体积预冷的无水乙醇，⁃20℃放置60 min后，12 000 r／min离心10 min；加500 μL预冷的70%乙醇，4℃12 000 r／min离心5 min，弃上清；待乙醇挥发后，用40 μL ddH2O溶解，⁃20℃保存备用。

异硫氰酸胍法［9］加入500 μL GPT试剂（6M异硫氰酸胍，50mM Tris（pH8．3），50%Tris饱和酚（pH 8．0），混匀，悬浮在沸水浴中15 min；轻微离心后，加入等体积氯仿⁃异戊醇（24∶1）试剂，混匀后，12 000 r／min离心10 min；取上清，加入等体积异丙醇混匀，⁃20℃放置60 min后，12 000 r／min离心15 min，弃上清，加入500 μL预冷的70%乙醇，轻轻颠倒试管2次，12 000 r／min离心5 min，弃上清，待乙醇挥发后，用40 μL ddH2O溶解，⁃20℃保存备用。

试剂盒法 参照酵母基因组DNA提取试剂盒（DP307）说明书操作，DNA产物用40 μL ddH2O溶解，⁃20℃保存备用。

碱裂解法［10⁃11］加入540 μL Solution I（0．9%葡萄糖，25mM Tris，6mM EDTA，pH 8．0），混匀，加入60 μL SolutionⅡ（1%SDS，0．2M NaOH），混匀，95℃加热10 min，加入300 μL SolutionⅢ（12% NaAc，12%冰醋酸），冰浴10 min，颠倒混匀；4℃12 000 r／min离心5 min，取上清，加入等体积异丙醇，混匀，⁃20℃放置60 min后；4℃12 000 r／min离心5 min，弃上清；加入200 μL 70%预冷的乙醇洗涤沉淀，12 000 r／min离心5 min，弃上清；待乙醇挥发后，用40 μL ddH2O溶解，⁃20℃保存备用。

1．5DNA浓度及纯度的测定

分别按上述方法提取DNA后，用紫外分光光度计测定样品OD260和OD280值，以ddH2O作为对照，然后按如下公式计算：DNA样品的浓度（μg／μL）＝OD260×稀释倍数×50 μg／μL DNA（核酸纯度的估计：OD260／OD280）。

1．6PCR扩增

模板DNA 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12．5 μL，加ddH2O至25 μL。反应条件［3］为：94℃预变性1 min，94℃变性40 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃后延伸5 min。PCR产物上样于1%的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结束后于凝胶成像系统观察拍照。

2　结果与分析

2．1紫外吸收光谱检测DNA含量

将4种方法提取的基因组DNA进行紫外吸收光谱检测（见表1～2），纯的DNA OD260／OD280比值对是1．8，纯的RNA是2．0。若比值太低（＜1．8）表明可能有酚或者蛋白质的污染；若比值太高（＞2．0）则可能有RNA的存在。表2显示碱裂解法所提取的DNA纯度值在1．7～1．9之间；其余三种方法所提取的DNA纯度值均在1．5～2．2之间；且碱裂解法所提取得DNA浓度最高，为30～60 μg／μL，其余三种方法提取的DNA浓度分别为0．4～13 μg／μL、8．0～18 μg／μL、9．0～58 μg／μL，可见碱裂解法提取的DNA纯度和浓度都较其他三种方法好。

表1　四种方法所测各样本DNA浓度值（ୱx±s）（μg／μL）Tab．1 Four methods for the concentration of the DNA（ୱx±s）（μg／μL）

表2　四种方法所测各样本核酸纯度值（OD值）Tab．2 Four methods for the purity of the DNA（OD value）

2．2PCR法检测DNA质量

将碱裂解法所提的基因组DNA进行PCR分析，结果表明：碱裂解法扩增条带具有较好的特异性，且带型清晰、明亮（见图1），适于PCR扩增。

图1　碱裂解法提取的基因组DNA PCR产物电泳图：M．Maker DL2000；Lane1⁃5．FHJU 1，CQMU 1，WHSU 4，FHPU 3，SHZU 2；Lane6．negative controlFig．1 PCR product of genomic DNA extracted by alkaline lysis

3　讨 论

真菌DNA提取方法的主要区别在于细胞壁、细胞膜的破坏及细胞器、蛋白质等物质的分离，由于真菌组成成分差异较大，因此不同菌种最合适的DNA提取方法会有一定差别。白永宏等［12］曾报道食用菌羊肚菌宜采用CTAB法提取，任衍春等［13］发现利用蛋白酶K法提取植物病原真菌水稻纹枯菌DNA的质量最好，而白假丝酵母菌［14］则适用于蜗牛酶法提取。可见对真菌样本开展基因鉴定、分型等相关研究之前，进行DNA提取方法的筛选十分必要。

球形孢子丝菌的细胞壁是由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖等组成，其结构不易充分裂解。常用的破壁方法有机械法、酶法和化学法等，液氮研磨一直是最常用的机械破壁方法，但该方法对材料的要求较为苛刻，菌体不仅需要干燥，而且操作繁琐，导致实验耗时长，对临床样本的快速鉴定并不适用，同时该方法在研磨过程中容易造成基因组DNA的断裂和不完整［15］。本实验以液体培养的菌体直接作为实验材料，利用四种不同方法破壁，试剂盒法为酶法，其余均为化学法。结果表明四种方法均能从菌体中成功获得基因组DNA，试剂盒法最为迅速，只需约2 h，而CTAB法所需时间最长约4 h，碱裂解法和异硫氰酸胍法耗时相当。DNA的纯度和浓度检测结果显示，碱裂解法最优，其次为试剂盒法，而CTAB法较差。这是由于碱裂解法中，NaOH和SDS加热煮沸这一破壁过程，反应比较剧烈，效果最彻底。试剂盒法选用的是酵母基因组提取试剂盒，利用溶菌酶进行破壁的方法对于丝状真菌可能效果并不理想。但离心管柱能特异性吸附DNA，因此该方法DNA纯化的效果会优于使用酚／氯仿／异戊醇和异丙醇沉淀法。CTAB破壁效果最差，这可能与实验材料有关，其更适用于液氮研磨处理的样品。另外，碱裂解法所用试剂均为常用试剂，而且对实验室的条件要求不高。因此，碱裂解法具有高效、简便、迅速的优点，是提取球形孢子丝菌DNA的理想方法。

参考文献

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［本文编辑］ 王 飞

·消息·

Comparison of DNA extraction methods from Sporothrix globosa

SHI Ying，CUI Yan，ZHAO Li⁃pei，SONG Yang，LI Shan⁃shan
（Department of Dermatology and Venereology，First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

【Abstract】Objective To find a rapid，effective and easy⁃to⁃perform DNA extraction protocol from Sporothrix globosa．Methods Four methods，such as CTAB⁃extraction，guanidine thiocyanate boiling⁃extraction，alkaline lysis⁃extraction，DNA extraction kit，were compared based on Sporothrix globosa isolates from different regions．The purity and yield of the DNA were determined by ultraviolet absorption spectrum．The DNA quality was evaluated with agarose gel electrophoresis and PCR amplification．Results It showed that all methods could get DNA，but alkaline lysis⁃extraction was better than others for the purity and yield of the DNA．Based on degener⁃ated primers of fragments of the calmodulin genes for PCR，we found all samples showed bright stripe．Conclusions Alkaline lysis⁃extraction is the most suitable method for extracting high quality DNA from Sporothrix globosa．

【Key words】Sporothrix globosa；Alkaline lysis⁃extraction；CTAB⁃extraction；Guanidine thiocyanate boiling⁃extraction；DNA extration

［收稿日期］2015⁃05⁃25

通讯作者：李珊山，E⁃mail：shansalee＠163．com

作者简介：石滢，女（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：442387194＠qq．com

基金项目：国家自然科学基金（81171509）；吉林省科技厅科技创新人才培育计划（20150520039JH）

【中图分类号】R 379．9

【文献标识码】A

【文章编号】1673⁃3827（2015）10⁃0216⁃04