三黄片对糖尿病模型大鼠氧化应激水平的影响实验

王芳玲 田风胜 王元松 马小允 贾彩霞 王庆凯宋哲

（沧州医学高等专科学校中医教研室，河北沧州 061001）

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，机体内高活性分子，如反应性氧化物和活性氮簇，产生过多或消除减少，从而导致组织损伤［1］。糖尿病合并动脉硬化是糖尿病慢性并发症的共同病理基础，氧化应激参与了动脉硬化的过程［2-3］。三黄片为临床常用清热类中药复方制剂，具有清热解毒的功效，研究表明清热类中药具有良好的抗氧化作用［4］。我们以丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）为观察指标，探讨三黄片对糖尿病模型大鼠氧化应激水平的影响，结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性Wistar大鼠50只，清洁级，体质量180～220 g，均由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号1009065。

1.2 主要试剂及仪器三黄片（哈药集团三精黑河药业有限公司，国药准字Z20053409）;SOD试剂盒、MDA试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所;链脲佐菌素（STZ）、柠檬酸钠（美国Sigma公司）;戊巴比妥钠（石家庄华瑞创新生物科技开发中心）;冰醋酸（河北健宁医药化工厂）;无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）;7600-010型全自动生化分析仪（日本日立公司）;752N型紫外-可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）;美国雅培安妥超越血糖仪，XCF028-1009型。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备［5-6］将50只大鼠随机分为2组，正常组12只，造模组38只。造模组大鼠禁食12 h后，将STZ用柠檬酸钠缓冲液配制成浓度1%、pH 4.2的溶液，按60 mg/kg一次性腹腔注射;正常组予等量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。72 h后尾静脉取血，测血糖≥16.7 mmol/L;尿糖（+ ++）～（++++），即可确定为糖尿病大鼠造模成功，稳定1周后列入研究对象。

1.3.2 分组及给药方法造模成功后，随机选取造模成功大鼠24只，分为糖尿病组、三黄片组，各12只。三黄片组给予三黄片研末10 g/kg灌胃;正常组、糖尿病组予等容积纯净水灌胃。给药期间观察大鼠饮水、活动、体质量及毛色等一般情况的变化。

1.4 观察指标及方法3组大鼠均连续灌胃饲养8周后，禁食12 h，取尾静脉血测定血糖，然后以3%戊巴比妥钠（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速开腹，分离腹主动脉，从腹主动脉采血，分离血清测定SOD及MDA。同时留取双侧肾脏，在冰冷的0.9%氧化钠注射液中漂洗，除去血液，滤纸拭干，除去肾包膜，分离皮质，取少许肾皮质加9倍质量预冷的0.9%氯化钠注射液在冰浴中制成10%肾组织匀浆，低温离心机离心，吸取上清液，分别检测SOD及MDA。

1.5 统计学方法采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析比较组间差异，有显著差异者用Student-Newman–Keuls test进行组间多重比较。

2 结果

2.13 组大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖变化比较见表1。

表13 组大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖变化比较mmol/L，±s

表13 组大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖变化比较mmol/L，±s

与正常组比较，*P＜0.05

组别n灌胃前灌胃8周后正常组124.88±0.704.88±0.54糖尿病组1223.13±3.43*24.51±3.10*三黄片组1222.38±2.21*23.40±3.21*

由表1可见，3组灌胃8周后血糖水平与本组灌胃前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）;糖尿病组及三黄片组灌胃前及灌胃8周后血糖水平均高于正常组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），且糖尿病组与三黄片组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.23 组大鼠灌胃前及灌胃8周后体质量变化比较见表2。

由表2可见，3组灌胃前体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05），体质量相当;灌胃8周后，正常组体质量与本组灌胃前比较增加，差异有统计学意义（P＜0.05）;糖尿病组及三黄片组体质量较灌胃前虽有所下降，但比较差异均无统计学意义（P＞0.05），且2组体质量均低于正常组且（P＜0.05）。

表23 组大鼠灌胃前及灌胃8周后体质量变化比较g，±s

表23 组大鼠灌胃前及灌胃8周后体质量变化比较g，±s

与灌胃前比较，*P＜0.05;与正常组比较，△P＜0.05

组别n灌胃前灌胃8周后正常组12196.5±13.6228.4±8.1*糖尿病组12205.7±16.2196.0±16.3△三黄片组12195.5±15.0192.0±12.6△

2.33 组大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比较见表3。

表33 组大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比较±s

表33 组大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比较±s

与正常组比较，*P＜0.05;与糖尿病组比较，△P＜0.05

组别nSOD（U/mL）MDA（nmol/mL）正常组12172.19±16.885.72±0.63糖尿病组12104.21±6.96*7.41±0.58*三黄片组12129.68±8.29＊△6.65±0.77＊△

由表3可见，糖尿病组及三黄片组灌胃8周后血清SOD及MDA水平与正常组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），SOD明显降低，MDA明显升高，但三黄片组SOD降低幅度及MDA升高幅度均低于糖尿病组（P＜0.05）。

2.43 组大鼠灌胃8周后肾脏组织SOD及MDA水平比较见表4。

表43 组大鼠灌胃8周后肾脏组织SOD及MDA水平比较±s

表43 组大鼠灌胃8周后肾脏组织SOD及MDA水平比较±s

与正常组比较，*P＜0.05;与糖尿病组比较，△P＜0.05

组别nSOD（mg prot）MDA（mg prot）正常组1239.09±4.172.79±0.74糖尿病组1226.73±3.17△4.63±0.92△三黄片组1233.74±3.05△＊3.77±0.55△＊

由表4可见，糖尿病组及三黄片组灌胃8周后肾脏组织SOD及MDA水平与正常组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），SOD均明显降低，MDA均明显升高，但三黄片组SOD降低幅度及MDA升高幅度均低于糖尿病组（P＜0.05）。

3 讨论

氧化应激作用机制可概括为活性氧分子生成增多或者活性氧分子清除减少，当氧化和抗氧化能力之间有不平衡时，氧化应激发生，糖尿病患者对氧化应激更敏感［7-8］，机体处于明显的氧化应激状态［9］。氧化应激是糖尿病慢性并发症发生发展的中间环节［10］，2004年Ceriello教授首先提出共同土壤学说［11］，即氧化应激是胰岛素抵抗、糖尿病及心血管疾病的共同发病基础。氧化应激在糖尿病发生发展过程中起重要作用，参与了动脉硬化的形成和进展［12］，胰岛素抵抗和糖尿病又增加了心血管疾病的发病率和病死率。因此，机体氧化应激水平增强与糖尿病慢性并发症的发病机制密切相关［13］。

MDA是脂质过氧化的产物，其高低可间接反映机体细胞受氧自由基损伤的程度，研究显示动脉粥样硬化患者血清MDA含量显著升高［14］。SOD是一种糖蛋白，可清除氧自由基及其分解产物，对细胞生物膜具有保护作用［15］。这2项指标常常被应用于反映机体氧化应激水平的研究。肾脏病变是糖尿病常见且重要的慢性并发症之一，因此我们同时选取大鼠肾脏组织测定SOD及MDA水平，以初步了解三黄片在影响血清SOD及MDA水平的同时对肾脏的作用，为后续研究奠定基础。

三黄片主要成分为大黄、黄连、黄芩，3味中药均为苦寒药，具有清热解毒、泻火通便的作用，临床上多用于治疗结膜炎、小儿急性口疮、急性扁桃体炎、急慢性胃肠炎、黄疸等证属实热者［16］。研究表明，清热类中药具有明显抗氧化作用，能升高SOD活性，抑制脂质过氧化［17-19］;同时具有显著抗动脉硬化的作用，预防糖尿病血管病变［20-22］;还能明显抑制肾脏细胞间黏附分子-1 （ICAM-1）及血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）水平的表达，对糖尿病肾病有积极防治作用［23］。既往文献尚无三黄片抗糖尿病氧化应激的研究报道，故本实验引申清热类中药的抗氧化作用，选三黄片作为研究对象。

本研究结果显示:①灌胃前糖尿病组及三黄片组大鼠血糖水平与正常组比较均显著升高（P＜0.05），糖尿病组及三黄片组比较无显著差异（P＞0.05）。灌胃8周后，3组血糖水平较灌胃前比较均无明显变化（P＞0.05），糖尿病组及三黄片组与正常组比较仍显著升高（P＜0.05），糖尿病组与三黄片组比较无明显差异（P＞0.05）。提示三黄片对糖尿病大鼠血糖水平无明显作用。②灌胃前3组大鼠体质量无差异（P＞0.05）。灌胃8周后，正常组大鼠体质量较灌胃前明显增加（P＜0.05），糖尿病组及三黄片组较灌胃前均无明显变化（P＞0.05）。提示糖尿病可影响大鼠正常生长，三黄片对改善大鼠体质量无明显作用。③灌胃8周后，糖尿病组及三黄片组与正常组比较血清SOD明显降低（P＜0.05），MDA明显升高（P＜0.05），且三黄片组变化幅度均低于糖尿病组（P＜0.05）。提示三黄片能够升高糖尿病大鼠血清SOD水平，降低MDA水平，从血清学水平具有抗氧化应激作用。④灌胃8周后，糖尿病组及三黄片组与正常组比较肾脏组织SOD明显降低（P＜0.05），MDA明显升高（P＜0.05），且三黄片组变化幅度均低于糖尿病组（P＜0.05）。提示三黄片能够升高糖尿病大鼠肾脏SOD水平，降低MDA水平，在组织学水平具有抗糖尿病氧化应激的作用。

本研究结果表明，三黄片对糖尿病模型大鼠具有明显抗氧化应激作用，可以升高SOD水平，降低MDA水平，预防糖尿病血管病变，预防动脉硬化，保护肾脏组织，从而为拓展清热类中药的临床应用提供了新思路，为新药的开发提供了实验依据。

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（本文编辑:石康）