特殊染色法对仔猪先天性黑色素瘤的鉴别

孙玉倩，李瑞珍，宋高杰，关佳佳，李晓青，赵俊江，梁莹莹，潘耀谦（河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003）



特殊染色法对仔猪先天性黑色素瘤的鉴别

孙玉倩，李瑞珍，宋高杰，关佳佳，李晓青，赵俊江，梁莹莹，潘耀谦＊
（河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003）

摘 要：为了诊断仔猪原发性黑色素瘤是良性还是恶性肿瘤，通过临床病理学观察，病理组织学的普通染色、特殊染色及脱黑色素等方法，对两例仔猪的黑色素瘤进行了观察。临床检查，两例仔猪均为出生后就发现有肿瘤，并随着仔猪的生长而不断变大。肿瘤呈半球形隆突于体表，表面有不同程度的破溃、出血和结痂。病理组织学检查，肿瘤具有完整的结缔组织包膜，肿瘤组织内有大小不等的分叶，在间质中浸润较多的淋巴细胞和单核细胞，具有良性肿瘤的特点。而肿瘤细胞呈多形性，如圆形、梭形、星形或长条形等；生长方式又是多样性，极性紊乱，如旋涡状、条索状、结节状、筛状等；瘤细胞还可浸润到间质等，又具有恶性瘤的特点。此外，肿瘤还可引起皮肤肥厚，汗腺细胞增生和毛囊萎缩。研究表明，猪先天性黑色素细胞瘤来源于皮肤的表皮，它虽然是一种良性肿瘤，但易向恶性肿瘤转化，因为瘤细胞的多形性及排列的极性紊乱具有恶性肿瘤的特点。

关键词：先天性黑色素瘤，病理组织学，特殊染色

黑色素瘤（melanoma）是由黑色素瘤细胞和瘤间质所构成的一种色素性肿瘤［1］。黑色素瘤在人群中发病率较高，多以恶性形式出现。根据美国最新发布的统计资料显示，世界上每年大约有16万人患黑色素瘤［2］。据报道在家畜中马、骡易患恶性黑色素瘤［3］，而犬、猪易患良性黑色素瘤［4-5］，但也有恶性病例的报道［6-8］。其他动物的黑色素瘤报道较少［9-10］。动物的黑色素瘤一般为继发性的，而原发性黑色素瘤的报道较少。目前，国外对黑色素瘤的研究主要集中在发病机理方面，即基因突变的研究［11-12］，国内多见于病例的报道。本文对两例仔猪的原发性黑色素瘤从临床表现，到眼观病变，结合病理组织学检查，并通过VG、Masson、PTAH等特殊染色法和脱黑色素法来分析良性和恶性黑色素瘤的特点，为兽医临床诊断和鉴别黑色素瘤提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

两例患先天性黑色素瘤的仔猪均来自河南科技学院兽医院，通过手术的方式，切除了肿瘤，用100 g/L福尔马林固定后进行病理组织学检查。

1.2方法

1.2.1切片制作 按常规方法进行，即将固定好的肿瘤组织经脱水、透明、浸蜡和包埋后，用Leica切片机制成5μm厚的切片，并用常规染色法（HE）染色。

1.2.2特殊染色 为了鉴别肿瘤组织中不同的成分，对组织切片分别做了汪吉松（VG）、马松三色（Masson）和磷钨酸苏木精（PTAH）染色。各种染色方法和步骤分别按常规进行。

1.2.3脱黑色素 为了鉴别肿瘤细胞有无异形性和分裂像，对肿瘤组织的切片进行了脱黑色素处理。其方法是：取数张切片脱蜡后浸入去离子水，待切片充分水合后放入盛有5g/L高锰酸钾溶液的立式染色缸，将染色缸放到盛有自来水的烧杯内，用电炉加热，至烧杯内的水沸腾后关电炉，冷却至室温后，取出切片，再用10mg/L草酸漂白3次，每次浸染1min，自来水洗2min，然后进行常规HE染色。

2　结果

2.1临床病理学观察

其中一例病猪出生时肩背部有一颗黄豆粒大小的结节，呈淡灰褐色，随着仔猪的生长，小结节也逐渐长大。50日龄前来就诊时，肿瘤呈半球形，直径约5cm。肿瘤表面溃烂、出血，并有黑褐色结痂。肿瘤有完整的包膜，与周围组织有较明显的分界（图1A）。另一例病猪出生时在臀部和膝上部各有一个榛子大小的结节，25日龄时结节达4cm大，呈半球形隆突于体表，表面有轻度的破损与结痂（图1B）。手术切除时，两例肿瘤均有较明显的蒂，有较厚而完整的包膜，

肿瘤的实质呈灰白色并见暗褐色斑块。手术切除检查，肿瘤主要位于真皮和皮下织，并未侵及深部组织（图1C）。

2.2病理组织学检查

2.2.1普通染色观察 切片经HE染色后，在低倍镜下检查，黑色素瘤主要位于真皮和皮下组织。由真皮增生的结缔组织伸入肿瘤中，将瘤组织分成形状和大小不一的小叶样结构，小叶的间质多少不等，宽窄不一，其中浸润有较多的淋巴组织，单核细胞，也有较多的黑色素瘤细胞浸润。真皮内的毛囊和皮脂腺萎缩，汗腺的腺腔扩张，部分汗腺上皮增生，形成覆层上皮。从黑色素瘤的起源与组织的联系观察，肿瘤主要发源于表皮基底部，是黑色素细胞恶变的结果。在表皮的棘细胞层和基底层的柱状细胞为黑色素瘤的起始部，此处可见大量黑色素瘤细胞增生（图2A），与正常的黑色素细胞相比，胞体较大，形态不一，含有大量黑色素。大量的黑色素瘤细胞从表皮延伸到真皮及皮下组织，形成一个整体。在瘤组织中，黑色素瘤细胞的大小不一，形态多样，有圆形、类圆形、梭形、星形或呈平滑肌细胞样的长条形等（图2B）；瘤细胞内由于含黑色素数量不同，所以颜色深浅不一，含黑色素少时，瘤细胞体积较小，呈浅褐色，细胞核较清晰；含黑色素多时，瘤细胞变大，体积悬殊，呈深褐色甚至是黑色，细胞核被黑色素掩盖而看不见。从排列上来看，肿瘤组织的极性紊乱，排列不整，常见的排列方式有旋涡状（图2C）、条索状、团块状（图2D）、小结状、筛状、编织状或席片状等。

2.2.2特殊染色观察 用Masson三色染色时结缔组织中的胶原纤维被染成绿色，骨骼肌纤维被染成红色。此时见瘤组织的外周有厚层绿染的胶原纤维，后者伸入瘤组织，将之分成大小不一的小叶；伸入皮肌中，将肌纤维的连接性破坏，红色的肌纤维镶嵌在绿色的胶原纤维间（图2E）。用PTAH染色时，皮肌中的骨骼肌纤维变成蓝色，肌纤维染色较深，胞浆呈均质状，横纹不清。胶原纤维染成砖红色，与肌纤维明显区分。用VG染色时，胶原纤维呈深粉红色，而肌纤维染成黄色。此时见位于肿瘤组织外围的纤维组织均为红染的胶原纤维，而无肌纤维（图2F）。特殊染色证明，HE染色时瘤组织中呈条索状类似肌纤维的组织，主要是胶原纤维，而皮肌中的骨骼肌纤维已变性和坏死。存在于肿瘤间质中的肌纤维，是肿瘤组织发生时，将皮肌破坏而形成的。

2.2.3脱黑色素结果 黑色素瘤组织的切片经过脱黑色素和用HE染色后，光镜下见肿瘤细胞中黑色素完全被脱去，或仅留少量细颗粒。脱色素后的瘤细胞大小似乎接近，但其的形态还是不一致的，有成熟的瘤细胞，也见幼稚的瘤细胞，梭形瘤细胞较多。在瘤组织的部分视野中常见瘤细胞的分裂像，偶见多极分裂像（图2G），但在肿瘤细胞形态不一和排列紊乱的部位，可见较多的核分裂像（图2H）。

图1　猪黑色素瘤的临床病理学检查Fig.1 Clinical pathological examination of melanoma in piglets

3　讨论

据报道［13-14］，黑色素瘤不论在人或动物中，多以恶性为主，所以，一般说到黑色素瘤都称为恶性黑色素瘤。实际上猪的黑色素瘤多以良性为主。本研究虽然只检查了两例猪的原发性黑色素瘤，但从中发现，不论常规染色，还是特殊染色，镜检时均可发现瘤细胞的排列呈多形态性，排列极性紊乱，有团块状、分叶状、条索状、巢状等；瘤细胞的形态呈多样，体积悬殊较大，有梭形、圆形、半圆形、类圆形、星形，甚至见到瘤巨细胞。脱黑色素后在瘤组织的不同部位，还可见到多少不一的分裂像。这种瘤细胞大小不一，排列极性紊乱和较多的分像，多为恶性肿瘤所具有的特点。据报道［15］，根据黑色素瘤细胞的形态，一般可将之分为3类，即上皮样细胞型、小上皮样细胞型和梭形细胞型。瘤细胞的排列方式，也与细胞的形态有密切的关系，如上皮样细胞型主要以巢状、片状结构排列，细胞为圆形，细胞核明显，胞浆丰富，体积较大；小上皮样细胞型成弥散分布，细胞为圆形、类圆形，深染后细胞核不明显，胞浆较少，体积较小；梭形细胞型主要以束状、条索状、旋涡状结构排列，细胞以梭形为

主，胞核呈卵圆形，胞浆少。由此可见，良性黑素瘤与恶性黑色素之间，瘤细胞及其排列方式有较多的共同特点，所以良性黑色素瘤极易向恶性黑色素瘤转化。

图2　猪黑色素瘤的病理组织学检查Fig.2 Histopathological examination of melanoma in piglet

一些病理组织学研究表明［1，12，15］，恶性黑色素瘤由于细胞的分化速度快，细胞较幼稚，所以形成的黑色素较少，瘤细胞中的黑色素多呈细胞颗粒状，较少形成大块状。本研究观察的2例猪黑色素瘤，成熟的瘤细胞中均有大量黑色素，有的呈块状，充满细胞浆，细胞核完全被黑色素掩盖，形成瘤巨细胞样的黑色素瘤细胞。肿瘤周围由结缔组织形成较完整的包膜，结缔组织伸入瘤实质，构成瘤间质，其中呈然有一些黑色素细胞浸润，但也有大量的淋巴细胞和单核细胞浸润，说明本瘤具有良性肿瘤的特征，再加上全身未发现转移灶，故将之诊断为良性黑色素瘤。

本研究应用一些特殊染色方法和脱黑色素方法，对肿瘤组织中的一些难以辨认的成分进行了鉴别，对于确定病性起到了重要作用。通过PTAH、VG和Masson三色染色，将肿瘤组织中的胶原纤维与肌纤维进行了区分，发现位于肿瘤包膜内来自于皮肌的肌骼肌纤维发生变性，横纹消失，肌浆深染。而位于肿瘤组织内的骨骼肌纤维则变性，坏死，断裂成碎块状。这说明位于肿瘤组织内的骨骼肌纤维是肿瘤从表皮发生时浸入皮肌并在其中不断生长而形成的。大量结缔组织包裹着肿瘤，但在肿瘤的间质内均有较多的肿瘤细胞浸润。脱去肿瘤细胞的黑色素后，更有便于观察瘤细胞的分裂像，此时发现在肿瘤组织的不同部位，均可见到分裂像，但在瘤细胞大小不一、排列不整的部位，分裂像较多。本研究通过对原发性黑色素瘤组织和细胞的形态观察，结合特殊染色的鉴别，发现猪原发性黑色素细胞瘤虽然仍属良性肿瘤，但它具备一些恶性肿瘤的特点，在一些特定的情况下很易转变为恶性黑色素瘤。

此外，本研究还观察到肿瘤对周围组织造成较大的影响，除了肿瘤所在部位的毛囊萎缩，皮脂腺消失和表皮过度增生肥厚外，还发现一些汗腺上皮增生，上皮细胞由一层变成多层，腺细胞体增大，腺腔变小。这说明在黑色素瘤发育增殖的过程中，也可以导致周围组织的其他成分发生增生或瘤变。

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Differentiation of Congenital Melanoma in Piglet with Special Staining Methods

SUN Yu-qian，LI Rui-zhen，SONG Gao-jie，GUAN Jia-jia，LI Xiao-qing，ZHAO Jun-jiang，LIANG Ying-ying，PAN Yao-qian
（College of Animal Science，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，Henan，453003，China）

Abstract：In order to identify the benign or malignant tumor of the congentital melanoma in piglet，2piglets with congentital melanoma were observed by means of the clinical and pathological observation，conventional staining，special staining and removal melanin method.When two piglets were born，their melanoma was found.The tumors were getting bigger with the growth of piglets.The tumors showed hemispherical protuberance on the skin.There were ulceration，bleeding and scab on the surface of tumors.Histopathologically，the melanoma possessed benign tumor characters，for example，the tumors had a complete connective tissue capsule in its outside，there were irregular leaflets in tumor tissue and more lymphocytes and mononuclear cells infiltrated in mesenchyme.But the melanoma also had malignant tumor characters，for example，the oncocytes were polymorphic，such as rotundity，fusiform and star-like，the growth pattern of tumor tissue also had diversity，such as swirly，cord-like，nodositas，cribriform and so on，the polarity of the tumor cells arrangement was in disorder，the oncocyte also could infiltrate to mesenchyme.In addition，the tumor also caused the dermatauxe，hyperplasia of sweat gland cell and atrophy of hair follicle.This research proved that the congentital melanoma in piglet originated from epidermis of skin.Although the congentital melanoma in piglet is a benign tumor，it is easily to becom malignant tumor.Because the oncocytes have the characters of malignant tumor cells，the oncocytes have polymorphism and the polarity of its arrangement is disorder.

Key words：congentital melanoma；histopathology；special staining

通讯作者

作者简介：孙玉倩（1988-），女，河南新乡人，硕士研究生，主要从事动物医学研究。＊

基金项目：河南省科技攻关项目（132102110118）

收稿日期：2014-08-29

中图分类号：S852.35

文献标识码：B

文章编号：1007-5038（2015）05-0128-04