一株鸽新城疫病毒的分离鉴定及F与HN 基因序列分析

钟植文，黎先伟，陈　珊，高绮静，刘镇明，杨傲冰＊（.广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州5356；.华南农业大学兽医学院，广东广州5064）



一株鸽新城疫病毒的分离鉴定及F与HN 基因序列分析

钟植文1，黎先伟1，陈珊1，高绮静1，刘镇明2，杨傲冰1＊
（1.广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州511356；2.华南农业大学兽医学院，广东广州510642）

摘 要：从广东珠三角地区某鸽场的发病鸽群采样，接种10日龄SPF鸡胚后分离到一株病毒，命名为JP株。系列微量血凝和微量血凝抑制试验结果表明，新城疫病毒（NDV）阳性。测序结果显示，该NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117，具有强毒株序列特点；F基因分型表明，JP株属于基因Ⅵ型。Blast结果显示，JP株F、HN基因序列均与基因Ⅵ型pi/CH/LGD/110208株同源性最高，均达99%。同源性比较发现，F和HN基因、蛋白都与基因Ⅵ型新城疫毒株同源性较高，分别为92.5%～99%、95.5%～99.1%和90.6%～98.7%、91.9%～99%，而与国内常用疫苗株B1、La Sota、Mukteswar等同源性较低，分别为83.2%～85.9%、89.2%～91%和79.3%～83.4%、86%～89.5%。分离的JP株属于基因Ⅵ型，并与国内常用疫苗株存在一定的差异。

关键词：鸽；新城疫病毒；F基因；HN基因；基因Ⅵ型

鸽新城疫俗称鸽瘟，又称鸽Ⅰ型副黏病毒病，是由鸽新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床发病为肠炎、下痢和神经症状为主要特征，是危害养鸽业的主要疫病之一［1］。该病最早在1977年发生于中东，现已在世界各地广泛流行［2］。近年来，我国各地常有鸽新城疫的发生［3-7］。国内外鸽场多用新城疫疫苗如Ⅰ系（Mukteswar）、Ⅱ系（B1）、Ⅳ系（La Sota）等免疫鸽群，在一些鸽场起到一定的预防作用，但常出现免疫失败。2013年冬，广东珠三角地区某鸽场的鸽群发病并出现死亡。病鸽精神萎靡，羽毛松乱，下痢，拉黄绿色稀粪，并出现扭头扭颈等神经症状。本试验从发病鸽群中采样，经病毒的分离、鉴定，确定为新城疫病毒。对分离株的F、HN基因进行序列测定和分析，并与近年来新城疫流行毒株和部分常用疫苗毒株F、HN基因的核苷酸序列、蛋白的氨基酸序列进行同源性比较和分析，旨在从分子水平上了解广东地区目前鸽新城疫病毒的毒力特点，为该病的预防和控制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样本 于2013年采自广东珠三角地区某鸽场的发病鸽群中10只有神经症状的鸽子的肺脏、气管和大脑等组织器官。

1.1.2实验动物 10日龄SPF鸡胚由广东永顺生物制药股份有限公司提供。

1.1.3血清和主要试剂 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV），禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H5、H7、H9标准阳性血清，购自广东省动物防疫监督所；MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、M-MLV反转录酶、RNasin、dNTP、Premix Ex Taq，购自TaKaRa（大连）有限公司。

1.2方法

1.2.1病毒分离和传代 采取发病鸽群的肺脏、气管、脑等内脏组织，将病料置于研磨器内，用含双抗（青霉素、链霉素各6 000U/mL）的生理盐水充分研磨，反复冻融3次，4 000r/min离心10min，吸取上清液，4℃作用2h，再经细菌滤器过滤除菌，保留滤液。滤液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚8只，0.2 mL/只，接种后置37℃温箱孵化，弃去24h内死亡鸡胚，以后每天照胚3次，将死亡鸡胚置于4℃冰箱过夜，至第96h将全部鸡胚置于4℃过夜。观察死亡鸡胚病变，收获死亡鸡胚和冻死鸡胚尿囊液，并进行无菌检查，然后连续传代。

1.2.2血凝试验和血凝抑制试验 参照文献［8］，配制10mL/L鸡红细胞悬液，取分离株鸡胚尿囊液

进行微量血凝试验；然后具有血凝活性的鸡胚尿囊液分别与新城疫病毒、减蛋综合征病毒和禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型的标准阳性血清进行微量血凝抑制试验。

1.2.3基因型鉴定

1.2.3.1引物设计 根据该毒株的初步试验结果，从GenBank上获取多株NDV基因序列分析比较后，使用DNA Star（Verison7.1）和Primer Premier（Verison 5.0）针对F和HN基因核苷酸序列的保守区域设计了2对特异性引物，用于扩增包含F、HN基因的核苷酸片段，所设计引物送上海英骏生物有限公司按照PAGE级别合成。F1：ACCAAACAGAGAATCCGTGAG，F2：CTTTAGCTCGGCAGCCATATCCTC，预期扩增1 993bp；HN1：TGAGCACATCATTCTGGAGACTTG，HN2：TGGACGATTTATTGCTAAGCTTG，预期扩增2 265bp。

1.2.3.2RT-PCR反应 用TaKaRa MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取分离株鸡胚尿囊液的病毒总RNA，用随机引物为反转录引物合成cDNA，再用针对新城疫病毒F和HN基因所设计的特异性引物进行PCR扩增检测，将RT-PCR扩增产物电泳检测结果。

1.2.3.3序列测定和分析 扩增产物经回收纯化后送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行序列测定，将测得的序列提交NCBI Blast SERVER进行联机检索。应用DNA Star（Version 7.1）软件分析其F蛋白裂解位点的氨基酸序列，并利用MEGA 6.0软件绘制系统进化树并确定基因型。从GenBank上获得B1、La Sota、Mukteswar、F48E9等不同基因型代表株的F、HN基因和氨基酸序列，结合本试验分离株的相应序列，利用DNA Star（Version7.1）软件包中的Meg Align软件进行同源性分析。

2　结果

2.1病毒分离和传代

经处理的病料接种10日龄SPF鸡胚，孵化68h开始出现死亡，死亡胚体全身出血，尤其是头、颈、脚出血明显（图1）。收获鸡胚尿囊液，无菌检查为阴性。

2.2血凝试验和血凝抑制试验

分离株的鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞血凝（HA）效价为7孔～8孔。而新城疫病毒、减蛋综合征病毒和禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型的标准阳性血清对分离株的血凝抑制（HI）效价分别为9孔、0孔、0孔、0孔、0孔，证明分离到的病毒株为新城疫病毒，命名为NDV/PIGEON/JM/2013（简称为JP）。

2.3RT-PCR扩增结果

利用特异性引物对JP株的RNA进行RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得与预期大小一致的目的片段（图2）。

2.4F、HN基因序列的测定及遗传进化分析

将测得的F、HN基因序列经NCBI Blast Server检索，均与GenBank上的Pigeon paramyxovirus 1 strain pi/CH/LGD/110208株（登录号：JX486550）的核苷酸序列同源性最高，均达到99%。利用DNA Star（Version 7.1）软件对JP株的F基因序列进行分析，F基因由1 792个核苷酸组成，含有一个长度为1 662个核苷酸的完整ORF，编码553个氨基酸，含有6个潜在的糖基化位点（85NRT、191NNT、366NTS、447NIS、471NNS和541NNT），以及13个半胱氨酸残基（25、27、76、199、338、347、362、370、394、399、401、424和523位），其中位于27、76、199、347和401位的半胱氨酸残基对F1、F2两个亚单位的连接比较重要。多数半胱氨酸残基集中在338-424aa之间，靠近C端的半胱氨酸残基的保守性对F蛋白的结构框架的维持具有一定意义。此外，F0裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-RF117，有多个碱性氨基酸的插入，具有新城疫病毒强毒的典型分子特征。基于JP株与GenBank中的不同基因型代表株的F基因47-421共375bp核苷酸序列，利用MEGA6.0软件分别绘制系统进化树（图3，圆形符号为分离株；三角符号为常用疫苗株）。遗传分析结果表明，JP株属于基因Ⅵ型，与pi/CH/ LGD/110208株（登录号：JX486550）的亲缘关系最近，而与IT-227/82株（登录号：AJ880277）、2736/00株（登录号：AY562989）、ASTR/74株（登录号：Y19012）、GB 1168/84株（登录号：AF109885）、CH-1/95株（登录号：AF001132）、Q-GB 506/97株（登录号：AF109887）等基因Ⅵ型新城疫病毒处于同一进化分支。

利用DNAStar（Version 7.1）软件对JP株的HN基因序列进行分析，HN基因由2 002个核苷酸组成，含有一个长度为1 716个核苷酸的ORF，预计编码571个氨基酸。根据HN的氨基酸同源性，新城疫病毒可分为A、B、C 3个群，分别为616、577和571个氨基酸。一般来说A群为弱毒，B群中弱毒株、中毒株、强毒株皆有，C群为强毒。按此判断，JP株属于C群，为新城疫病毒强毒株。

2.5F、HN基因和蛋白序列同源性分析

利用DNA Star（Version 7.1）软件包中的Meg

Align软件对JP株F和HN基因核苷酸、蛋白氨基酸序列与GenBank上获得毒株的相应序列进行同源性比较。结果表明，JP株F基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列与pi/CH/LGD/110208株等基因Ⅵ型的新城疫毒株同源性较高，分别为92.5%～99% 和95.5%～99.1%，而与国内常用疫苗株及其效检株B1、La Sota、Mukteswar、F48E9等相对序列同源性较低，分别为83.2%～85.9%和89.2%～91%（图4）。JP株HN基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列与pi/CH/LGD/110208株等基因Ⅵ型的新城疫毒株同源性较高，分别为90.6%～98.7%和91.9% ～99%，而与国内常用疫苗株B1、La Sota、Mukteswar等相对序列同源性较低，分别为79.3%～83.4%和86%～89.5%（图5）。由此可见，分离的JP株与国内常用疫苗株及其效检株存在了一定的差异。

图1　接种JP株后的SPF鸡胚情况Fig.1 SPF chicken embryos inoculated with JP strains

图2　分离株F和HN基因的RT-PCR扩增产物Fig.2 RT-PCR products of F gene and HN gene of the isolate

图3　分离株的F基因的系统进化树Fig.3 Phylogeny tree of F gene of the isolate

图4　分离株与参考毒株F基因推导氨基酸序列同源性比较Fig.4 Comparison on homology of the deduced amino acid sequences of F gene of the isolate and reference strains

图5　分离株与参考毒株HN基因推导氨基酸序列同源性比较Fig.5 Comparison on homology of the deduced amino acid sequences of HN gene of the isolate and reference strains

3　讨论

本次分离的鸽源新城疫病毒JP株的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117，具备新城疫病毒强毒株的特征。参照文献［9］，基于F基因47-421共375bp的核苷酸序列进行基因分型，JP株属于基因Ⅵ型的新城疫病毒。

目前认为，鸽新城疫起源于鸡新城疫，是鸡新城疫病毒长期适应鸽体内环境并在鸽体内发生变异所导致的。鸽新城疫病毒的生物学特性不一定与其F蛋白裂解位点的氨基酸序列表现一致，也就是F蛋白裂解位点的特征性结构不完全决定鸽新城疫的毒力。本试验分离的JP株F蛋白裂解位点为112RR-Q-K-R-F117，HN蛋白含有571个氨基酸，具有强毒株的分子特征，但是否强毒株还应进行相应的生物学特性试验和动物试验给予确定［10-11］。

目前，国内应用的新城疫疫苗株主要有B1、La Sota、Mukteswar等，均属于基因Ⅱ型和基因Ⅲ型，而用于疫苗效力检验的北京强毒株F48E9属于基因Ⅸ型，但当今国内鸽群中流行的新城疫毒株中基因Ⅵ型占多［12-14］。不同基因型的毒株进行核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性分析显示，不同基因型之间序列同源性较低，差异较大，相同基因型之间序列同源性较高，差异较小。由此可见，目前疫苗株与鸽群流行株之间已经有较明显的核苷酸、氨基

酸序列以及抗原性差异，当前使用的疫苗株不一定能够提供100%的完全保护［15-16］。

鸽新城疫的防制，不能单靠疫苗免疫预防，要结合隔离、消毒等生物安全措施来综合防治。鸽子对Ⅰ系（Mukteswar株）中强毒活苗较敏感，对普通油苗佐剂反应又较大，因此单靠Ⅳ系（La Sota株）弱毒活苗，难以提供长久有效的保护，宜结合应用有效的鸽群专用（含有基因Ⅵ型毒株）的优质灭活苗进行适当补免，这有可能减少非典型新城疫的发生，或者降低其危害。

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Isolation，Identification and Sequence Analyses of F and HN Genes of One Newcastle Disease Virus Strain in Pigeons

ZHONG Zhi-wen1，LI Xian-wei1，CHEN Shan1，GAO Qi-jing1，LIU Zhen-ming2，YANG Ao-bing1
（1.Guangdong Win-sun Bio-pharmaceutical Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong，511356，China；
2.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong，510642，China）

Abstract：Some sick pigeons were sampled from pigeon farm in Pearl River Delta region，and used to inoculate 10day-old SPF chicken embryos，and a virus strain named JP was isolated.The positive result of Newcastle disease virus was determined by HA and HI tests.The result of sequence analysis showed that the amino-acid sequence of the fusion protein cleavage site was 112R-R-Q-K-R-F117，a typical sequence of virulent strains.Genetic analysis showed that the isolate belonged to genotypeⅥ.The result of Blast showed that the sequences of F and HN genes of the isolate have the highest identities with the genotype ⅥNDV（pi/CH/LGD/110208），both with 99%.The homology analyses of F and HN genes and proteins showed that the isolate were high identities with the genotypeⅥNDV，with 92.5%-99%，95.5%-99.1% and 90.6%-98.7%，91.9%-99%，respectively，but low identities with the common vaccine strains，such as B1，Mukteswar and La Sota，only with 83.2%-85.9%，89.2%-91%and 79.3%-83.4%，86%-89.5%，respectively，the isolate differs from the common vaccine strains.

Key words：pigeon；Newcastle disease；F gene；HN gene；genotypeⅥ

通讯作者

作者简介：钟植文（1980-），男，广东台山人，硕士，主要从事家禽家畜传染病研究。＊

收稿日期：2014-09-12

中图分类号：S852.659.5

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）05-0087-05