顶空气相色谱法测定阿哌沙班原料药中有机残留溶剂的残留量

张 辉，张琳美，周 慧

(1.天津市南开区中医医院，天津 300102； 2.天津医科大学，天津 300070)

1.甲醇 2.乙醇 3.丙酮 4.二氯甲烷

5.乙酸乙酯 6.正丁醇 7.吡啶 8.甲苯 9.DMF



顶空气相色谱法测定阿哌沙班原料药中有机残留溶剂的残留量

张 辉1，张琳美1，周 慧2

(1.天津市南开区中医医院，天津 300102； 2.天津医科大学，天津 300070)

目的： 建立了测定阿哌沙班原料药中的甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、吡啶、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)含量的顶空气相色谱法：采用DB-624 毛细管柱(30.0 m×0.53 mm，3.00 μm)(6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷共聚物)， 氢火焰离子化检测器(FID)，程序升温，进样口温度220 ℃，检测器温度250 ℃，分流进样模式，测定残留溶剂的含量。结果：9种残留溶剂在各自的浓度范围内具有良好的线性关系(相关系数均为0.999以上)，回收率符合规定。结论：本方法专属性强，操作简便，结果可靠，可用于9种残留溶剂的同时测定。

阿哌沙班，顶空气相色谱法，残留溶剂

阿哌沙班(apixaban)是百时美施贵宝和辉瑞公司共同研发的抗凝血剂，直接作用于凝血因子Ⅹa，用于治疗包括深静脉血栓(deep venous thrombosis，DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism，PE)在内的静脉血栓疾病。国内目前对于阿哌沙班相关的文献报道较少[1-3]，本实验对于阿哌沙班原料中有机溶剂的残留进行了研究。在该药的合成工艺与精制过程中，需要用到甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、吡啶、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)9种有机溶剂，《中国药典》和ICH对各类溶剂残留量有严格的规定[4，5]。本实验首次建立了毛细管柱顶空气相色谱法，测定阿哌沙班工艺中用到的9种溶剂，并进行了方法学研究。结果显示，方法专属性强，操作简便，结果可靠，可用于9种残留溶剂的同时测定。

1 仪器与试药

Agilent 7890 气相色谱仪(Agilent公司)，G1888 顶空进样器(Agilent公司)，氢火焰离子化检测器(FID)，Agilent气相工作站，DB-624 毛细管柱(美国Agilent 公司)，甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、吡啶、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯，均购买于天津市凯信化学工业有限公司。阿哌沙班原料药(某药业公司提供，批号20131001，20131002，20131003)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 DB-624毛细管柱(30.0 m×0.53 mm，3.00 μm)(6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷共聚物)，程序升温，50 ℃维持1 min；5 ℃/min升至140 ℃，维持2 min；50 ℃/min升至200 ℃，维持2 min；载气N2，流速：2.0 ml/min。G1888顶空进样器，进样口温度为220 ℃，分流比为10∶1；顶空瓶温度90 ℃，定量环温度100 ℃，传输管线温度110 ℃，瓶加热时间30 min，顶空瓶体积10 ml，加入被测液体2 ml，加盖密封。火焰离子化检测器(FID)，温度250 ℃，氢气流速 40 ml/min，空气流速 400 ml/min，尾吹30 ml/min。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照储备溶液的配制 分别精密移取甲醇47 μl(约37.2 mg)，乙醇79 μl(约62.3 mg)，丙酮79 μl(约62.3 mg)，二氯甲烷5.6 μl(约7.4 mg)，乙酸乙酯69 μl(约62.2 mg)，正丁醇77 μl(约62.4 mg)，吡啶2.5 μl(约2.5 mg)，甲苯13 μl(约11.3 mg)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)12 μl(约11.3 mg)到25 ml量瓶中，用DMSO稀释至刻度，混匀。

2.2.2 对照溶液的配制 吸取上述对照储备溶液5 ml置50 ml量瓶中，用DMSO稀释到刻度，混匀。残留限度见表1。

2.2.3 供试品溶液的配制 取供试品100 mg，精密称定，置10 ml顶空瓶中，加入2 ml DMSO，加盖密封。

表1 溶剂残留限度表

2.3 专属性试验 取2 ml DMSO置顶空瓶中，加盖密封，顶空进样测定，记录色谱图。结果表明：DMSO对乙醇的测定有少量干扰(峰面积为1.7)，对其他溶剂的测定基本无干扰。精密量取上述对照溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，9个成分之间分离度均 >1.5，且理论塔板数均大于70 000，色谱图见图1。

1.甲醇 2.乙醇 3.丙酮 4.二氯甲烷

5.乙酸乙酯 6.正丁醇 7.吡啶 8.甲苯 9.DMF

图1 空白溶液(A)对照品(B)供试品(C)气相色谱图

2.4 检测限试验 移取标准溶液用DMSO逐步稀释，

各色谱峰响应值约为基线噪音的3倍。甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、吡啶、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的最低检测浓度分别为1.49、1.00、0.25、1.19、0.31、3.12、1.22、0.22和11.35 μg/ml。

2.5 线性关系测定 分别移取对照贮备液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5和2.0 ml置10 ml量瓶中，用DMSO稀释到刻度，混匀，配成不同浓度的测试溶液；分别取各溶液2 ml置10 ml顶空瓶中，加盖密封，依次进样测定。试验结果见表2。

2.6 精密度试验 取对照溶液2 ml置10 ml顶空瓶中，加盖密封，顶空进样测定，记录色谱图。重复进样6次，计算各溶剂峰面积的RSD。结果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、吡啶、甲苯和DMF色谱峰积分面积的RSD分别为0.94%、0.45%、0.60%、0.67%、0.60%、1.01%、1.38%、0.66%和1.46%，表明进样精密度良好。

2.7 稳定性试验 分别于0、2、4、9、32和55 h取对照溶液2 ml置10 ml顶空瓶中，加盖密封，顶空进样测定，记录色谱图。计算各溶剂的峰面积的RSD。结果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、吡啶、甲苯和DMF色谱峰积分面积的RSD分别为2.01%、1.24%、1.42%、0.72%、1.27%、1.98%、4.82%、1.49%和2.48%，表明对照溶液在55 h内稳定性良好。

表2 线性关系试验结果

2.8 回收率试验 分别移取标准贮备液0.8、1.0和1.2 ml置10 ml量瓶中，加DMSO稀释到刻度，混匀。称取20131001批样品100 mg共10份，置10 ml顶空瓶中，分别移取DMSO及各浓度溶液2 ml，加盖密封，加热使其溶解，顶空进样测定，记录色谱图。结果见表3。甲醇的平均回收率为98.85%、RSD为2.85%；乙醇的平均回收率为100.97%、RSD为2.55%；丙酮的平均回收率为100.66%、RSD为1.79%；二氯甲烷的平均回收率为104.07%、RSD为3.23%；乙酸乙酯的平均回收率为100.90%、RSD为1.74%；正丁醇的平均回收率为102.97%、RSD为2.82%；吡啶的平均回收率为78.44%、RSD为4.91%；甲苯的平均回收率为99.97%、RSD为1.83%；DMF的平均回收率为108.80%、RSD为3.94%。

表3 回收率试验结果

2.9 样品测定 取3批样品，精密称取100 mg到顶空瓶中，加水2 ml溶解，加盖密封，按上述色谱条件以外标法进行测定。结果见表4。

表4 样品测定结果

3 讨论

3.1 溶剂的选择 考查了DMSO(二甲基亚砜)与水，发现样品在DMSO中能完全溶解，且DMSO溶解性好，沸点高，因此选择DMSO作为溶剂。

3.2 色谱柱的选择 考查了DB -1、DB-624和DB-WAX 3种不同极性的色谱柱，由于要检测9种残留溶剂，色谱柱极性太大或者太小都不利于分离，通过试验比较，最终选用中等极性的DB-624色谱柱，在此色谱柱上9种有机溶剂完全分离。

本文首次采用顶空气相色谱法对阿哌沙班原料药9种残留溶剂进行检测。方法验证证明：该方法色谱条件分离良好，灵敏度高，在考查的浓度范围内线性关系良好(r>0.999)，回收率符合规定，符合《中国药典》 2010版附录Ⅷ P中有机溶剂残留量测定的要求，可以作为阿哌沙班原料药中残留溶剂的质量控制方法。

1 付强强, 韩佩, 宫平. 阿哌沙班合成路线图解[J]. 中国药物化学杂志，2012, 22(2)：167-169

2 王磊, 钟静芬, 时惠麟. 口服Ⅹa因子直接抑制剂阿哌沙班的临床研究进展[J].上海医药，2012, 33(17): 17-20

3 黄仲义. 口服凝血因子Ⅹa 直接抑制剂阿哌沙班的临床药理学[J].中国新药与临床杂志，2013, 32(7): 530-533

4 中国药典[].二部.2010: 附录61-65

5 周海钧. 药品注册的国际技术要求(质量部分)[M].北京: 人民卫生出版社, 2001: 82

2015-07-08

R927.11

A

1006-5687(2015)05-0024-03