DADS对人白血病细胞和淋巴瘤细胞诱导凋亡作用比较研究

易 岚，李林蔚，谭 晖，何 洁，胡劲松，谢红艳，苏 琦

（南华大学1.药学与生物科学学院、2．肿瘤研究所，湖南衡阳 421001）

DADS对人白血病细胞和淋巴瘤细胞诱导凋亡作用比较研究

易 岚1，2，李林蔚1，谭 晖2，何 洁2，胡劲松1，谢红艳1，苏 琦2

（南华大学1.药学与生物科学学院、2．肿瘤研究所，湖南衡阳 421001）

A comparative study of apoptosis in diallyl disul-fide-induced human leukemia cells and lymphoma cells

YI Lan1，2，LI Lin-wei1，TAN Hui2，HE Jie2，HU Jing-song1，XIE Hong-yan1，SU Qi2
（1．College of Pharmacy and Biological Sciences，2．Cancer Re-search Institute，University of South China，Hengyang，Hunan，421001，China）

网络出版时间：2015－10－16 9：52 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．060．html

大蒜及其烯丙基硫化物的抗肿瘤作用正日益受到关注［1－2］。我们的前期研究显示，DADS对人白血病HL-60细胞具有双效作用，小剂量DADS（＜1.25 mg·L－1）诱导人白血病细胞分化，而中等剂量DADS（＞1．25 mg·L－1）可诱导人白血病细胞凋亡［3－4］。我们的前期研究表明，Rac2与DADS诱导人白血病细胞凋亡相关［5］，且DADS通过活性氧介导的JNK信号通路诱导HL-60细胞的凋亡，且NADPH氧化酶的活化是DADS诱导HL-60细胞凋亡过程ROS的主要来源［6－7］。本研究在前期工作基础上，比较DADS对人早幼粒白血病系HL-60细胞、人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞、人何杰金式淋巴瘤细胞系Raji细胞的增殖抑制作用、诱导凋亡作用，同时也比较了DADS对这3种细胞活性氧产生以及Rac2的表达的影响。为进一步阐明DADS诱导肿瘤细胞凋亡的机制，为肿瘤细胞的诱导凋亡治疗提供新思路。

1　材料与方法

1．1药品与试剂 DADS为Fluka公司产品；BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品；2′，7′-二氯氢化荧光素二脂（DCFH-DA），Rac2等一抗为Santa Cruz公司产品（sc-96）。二抗（sc-2774）为Abcam Biotechnology公司产品。

1．2方法

1．2．1细胞培养 细胞培养采用常规培养，培养液为含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，饱和湿度，5%CO2，每3－4天换液传代。

1．2．2MTT检测 细胞接种于96孔板，常规培养72 h。于结束前4 h除对照组外，每孔加MTT溶液孵育4 h，终止培养。离心弃上清。酶联免疫检测仪上测各孔吸光度，检测波长570 nm，按下列公式计算抑制率（IR%）。IR%＝（1－实验组OD570／对照组OD570）×100%。

1．2．3RT-PCR检测 利用Primer Premier 5．0软件进行引物设计。β-actin正义引物序列为5′-CCTGTACGCCAACA-CAGTGC-3′，反义引物序列为：5′-ATACTCCTGCTTGCT-GATCC-3′，产物长度为211 bp；RAC2正义引物序列为：5′-TCATCTGCTTCTCCCTCGT-3′，反义引物序列为：5′-GATG-GTGTCCTTGTCGTCC-3′，产物长度为143 bp。提取细胞总RNA；cDNA合成；PCR反应；反应结束后取5 μL产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1．2．4细胞内活性氧检测 收集细胞，加入DCFH-DA充分混匀，常温避光反应50 min，洗涤细胞3次，重悬细胞，37℃条件下水浴10 min，流式细胞仪分析荧光强度，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

1．2．5Western blot检测 细胞裂解：分别收集各组细胞，加入裂解液，冰上裂解，获细胞总蛋白。蛋白变性，电泳，转膜；封闭，孵一抗，洗膜，孵二抗，洗膜后，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

1．2．6凋亡细胞百分率检测 收集细胞，预冷PBS重悬，离心。用75%乙醇固定细胞，加碘化丙啶（PI），避光振荡混匀，DNA含量低于2n的细胞百分数为凋亡细胞百分率。

1．3统计学处理 采用SPSS 19.0统计分析软件，Student′t-test法进行差异显著性分析，数值用±s表示。

2　结果

2．1DADS对HL-60细胞、K562细胞、Raji细胞增殖抑制作用 MTT实验结果显示，DADS以剂量依赖方式抑制这3种细胞的生长活性，DADS作用HL-60、K562、Raji细胞的IC50值结果也表明，相同浓度的DADS对K562细胞、HL-60细胞的生长抑制作用明显强于对Raji细胞的生长抑制作用（P＜0.05）。

Tab 1 OD570value of different concentration DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 48 h

2．2DADS对HL-60细胞、K562细胞、Raji细胞诱导凋亡作用 流式细胞术检测凋亡细胞百分率结果显示，DADS能诱导人白血病HL-60细胞、K562细胞以及Raji细胞凋亡。相同浓度DADS作用上述3种细胞，Raji凋亡细胞百分率明显低于HL-60细胞和K562细胞（P＜0.05）。

Tab 2 Percentage of apoptosis cells of different concentrations of DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 24 h．

2．3DADS对HL-60细胞、K562细胞、Raji细胞活性氧产生的影响 DCFH-DA染色后，流式细胞术检测细胞荧光强度结果显示，3.0、6.0、12.0 mg·L－1DADS作用上述3种细胞8 h后，HL-60细胞、K562细胞的荧光强度呈浓度依赖性增加，但在24．0 mg·L－1DADS作用下，荧光强度稍有下降。相同浓度DADS作用Raji细胞，细胞内荧光强度明显低于HL-60细胞和K562细胞（P＜0.05）。

Tab 3 Fluorescence intensity of different concentrations of DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 8 h

2．4DADS对HL-60细胞、K562细胞、Raji细胞Rac2表达的影响 RT-PCR、Western blot分析结果显示：6．0 mg·L－1DADS作用HL-60细胞和K562细胞24 h后，较未处理组相比，Rac2的表达均明显上调（P＜0.05）；而12．0 mg·L－1DADS作用Raji细胞24 h后，较未处理组相比，Rac2的表达却明显下调（P＜0.05）。

3　讨论

本研究表明，首先，DADS作为一种有潜力的抗肿瘤药物，不仅能抑制HL-60细胞、K562细胞以及Raji细胞的活性和增殖，同时能诱导这3种细胞凋亡，且DADS对HL-60细胞、K562细胞的抑制增殖能力和诱导凋亡能力明显强于Raji细胞人白血病HL-60细胞凋亡。其次，在DADS诱导3种细胞凋亡的过程中均有ROS的增加，NADPH氧化酶的活化是DADS诱导HL-60细胞、K562细胞凋亡过程ROS的主要来源，而不是DADS诱导Raji细胞凋亡过程中ROS的主要来源。当然，DADS诱导肿瘤细胞凋亡作用效果以及具体机制还有待于进一步研究。

参考文献：

［1］ Yi L，Su Q．Molecular mechanisms for the anti-cancer effects of diallyl disulfide［J］．Food and Chem Toxicol，2013，57：362－70．

［2］ Huang YS，Xie N，Su Q，et al．Diallyl disulfide inhibits the prolif-eration of HT-29 human colon cancer cells by inducing differential-ly expressed genes［J］．Mol Med Report，2011，4（3）：553－9．

［3］ Zhao J，Huang W G，He J，et al．Diallyl disulfide suppresses growth of HL-60 cell through increasing histone acetylation and p21WAF1 expression in vivo and in vitro［J］．Acta Pharmacol Sin，2006，27（11）：1459－66．

［4］ 黄卫国，谭 晖，易 岚，等．二烯丙基二硫上调p21、STAT1 和CAMTA1诱导人白血病K562细胞分化［J］．中国药理学通报，2010，26（4）：513－6．

［4］ Huang W G，Tan H，Yi L，et al．Diallyl disulfide up-regulate p21、STAT1 and CAMTA1 induce differentiation of human leuke-mia K562 cells［J］．Chin Pharmacol Bull，2010，26（4）：513－6．

［5］ Yi L，Zeng X，Tang H，et al．Proteomics analysis of apoptosis ini-tiation induced by diallyl disulfide in human leukemia HL-60 cells ［J］．Chin J Cancer，2009，28（1）：43－8．

［6］ 易 岚，谭 晖，吉晓霞，等．DADS通过活性氧介导的JNK信号通路诱导人白血病K562细胞凋亡［J］．中国药理学通报，2013，29（4）：473－7．

［6］ Yi L，Tan H，Ji X X，et al．Diallyl disulfide induces apoptosis in human leukemia K562 cells through activation of JNK mediated by reactive oxygen［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29（4）：473－7．

［7］ 易 岚，伍尤华，谭 晖，等．二烯丙基二硫活化NADPH氧化酶诱导人白血病K562细胞凋亡［J］．中国药理学通报，2014，30（8）：1107－12．

［7］ Yi L，Wu Y H，Tan H，et al．Diallyl disulfide induces apoptosis in human leukemia K562 cells through activation of NADPH oxidase ［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30（8）：1107－12．

中国图书分类号：R329．25；R733．7；R733．41；R916．4

关键词：DADS；HL-60细胞；K562细胞；Raji细胞；Rac2；活性氧；凋亡

Key words：DADS；HL-60 cells；K562 cells；Raji cells；Rac2；ROS；apoptosis

作者简介：易 岚（1976－），女，博士，副教授，研究方向：白血病发病及防治分子机制，Tel：0734-8281659，E-mail：yilanoky＠126．com；苏 琦（1945－），男，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤发病及防治分子机制，通讯作者，Tel／Fax：0734-8281547，E-mail：suqi1＠hotmail．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81400117）；中国博士后基金（No 2014M562115）；湖南省自然科学基金资助项目（No 2015JJ4042）；南华大学归国人员科研启动资金项目（No 2014XQD46）

收稿日期：2015－07－13，修回日期：2015－08－23

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）11－1627－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．030