下调组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶1的表达引起人白血病Molt-4细胞的凋亡

许可珍，黄轶群，黄秀旺，马旭东

（福建医科大学附属漳州市医院1．药学部、2．血液内科，福建漳州 363000；3．福建医科大学药学院，福建福州 350004）

下调组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶1的表达引起人白血病Molt-4细胞的凋亡

许可珍1，黄轶群2，黄秀旺3，马旭东2

（福建医科大学附属漳州市医院1．药学部、2．血液内科，福建漳州 363000；3．福建医科大学药学院，福建福州 350004）

中国图书分类号：R341．27；R341．7；R329．25；R733．7；R977．4；R977．6

摘要：目的 观察LSD1基因对人类急性T淋巴母细胞性白血病Molt-4细胞增殖和凋亡的影响。方法 设计并筛选出针对LSD1基因的最佳siRNA片段，将其转染入Molt-4细胞后，MTS法观察LSD1 siRNA对Molt-4细胞增殖的影响；流式细胞术分析细胞凋亡；Western blot检测LSD1 siRNA作用后组蛋白H3K4、H3K9甲基化及组蛋白H3乙酰化状态，以及p15、DNA甲基化酶1（DNMT1）和凋亡相关蛋白Bcl-2、pro-caspase-3的表达变化。结果 沉默LSD1基因可抑制细胞增殖，LSD1 siRNA浓度为0、30、60、120 nmol·L－1作用48 h后，Molt-4细胞的增殖率分别为（99.65±1.21）%、（83.02± 1.69）%、（65.72±2.16）%、（41.15±2.23）%，差异具有统计学意义（P＜0.05）；LSD1 siRNA以60 nmol·L－1的浓度转染细胞0、24、48、72 h，增殖率分别为（99.86± 1.35）%、（65.72±2.16）%、（48.26±1.92）%、（37.86± 1.66）%，P＜0.05，提示LSD1 siRNA可以抑制Molt-4细胞的增殖。LSD1 siRNA 0、30、60、120 nmol·L－1作用48 h后，细胞凋亡率分别为（3.35±1.26）%、（12.16±1.74）%、（32.74±2.47）%、（54.64±2.58）%，P＜0.05，凋亡率随着LSD1 siRNA浓度的增加逐渐上升；同时出现凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-3的表达下降；LSD1 siRNA抑制LSD1蛋白及LSD1 mRNA，上调组蛋白H3K4一甲基化、二甲基化及组蛋白H3的乙酰化水平，H3K4三甲基化、H3K9甲基化水平无明显变化；LSD1 siRNA下调DNA去甲基化酶DNMT1的表达，上调p15的表达。结论 LSD1 siRNA能抑制Molt-4细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制可能与表观遗传学调控有关，有望成为白血病治疗的一个新的靶点。

关键词：急性白血病；LSD1；组蛋白；甲基化；乙酰化；表观遗传学

网络出版时间：2015－10－16 9：52 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．048．html

赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（lysine spe-cific demethylase 1，LSD1）是2004年被人们发现的第1个组蛋白赖氨酸去甲基化酶。LSD1定位于细胞核内，调控着基因转录的激活和抑制，在肿瘤发生和胚胎发育过程中起着重要的作用。它是一个黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinulcleotide，FAD）依赖性胺氧化酶，能够特异性地脱去组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4）和H3K9位点上的单甲基化和二甲基化甲基基团［1］。有研究发现，LSD1可通过多种途径参与肿瘤的发生，例如LSD1可能广

泛地调控基因表达并且参与前列腺癌的进展及恶化［2］，与乳腺癌、卵巢癌、肝癌的发展也密切相关［3－5］。

目前H3K4去基化酶LSD1的研究不多，特别是用对RNAi沉默技术研究LSD1后肿瘤细胞的增殖及凋亡以及对组蛋白调控及DNA甲基化影响的报告少见。本研究通过RNAi沉默LSD1基因，探讨LSD1基因对急性T淋巴母细胞性白血病Molt-4细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化、乙酰化及DNA甲基化的影响，探讨LSD1基因在白血病靶向治疗中的可能性。

1　材料与方法

1．1试剂 RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），siRNA及PCR引物委托上海吉玛制药技术有限公司合成，Li-pofectamineTM2000转染试剂、Opti-MEM RT-PCR试剂盒、DNA Marker试剂购自美国Invitrogen公司，细胞增殖检测（MTS）试剂盒（Promega公司），Annex-in V-FITC／PI双染试剂盒（BD公司），一抗：p15、Bcl-2、procaspase-3（美国Santa Cruz公司），Anti-ac-etyl-Histone H3、Anti-acetyl-Histone H4、Anti-trimeth-yl-Histone H3（Lys9）、Anti-acetyl-Histone H3 （Lys9）、Anti-acetyl-Histone H3（Lys14）、Anti-acetyl-Histone H3（Lys27）购自美国Upsate公司。羊抗兔、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）。

1．2Molt-4细胞培养 Molt-4细胞购自中国科学院上海细胞库。Molt-4细胞培养条件：含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基（含青霉素105U· L－1＋链霉素100 mg·L－1）并在37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中培养。将Molt-4细胞复苏后，2～3 d规律传代。转染前选择对数生长期细胞，离心收集并接种于6孔培养板中，细胞数为2×106个／孔。

1．3靶序列的选择 siRNA的有关序列由上海吉玛制药技术有限公司设计及合成，为了避免只选择一个序列可能出现无效或低效的情况，我们根据确定序列的原则选择4条靶序列，并用RT-PCR法筛选最佳LSD1基因的siRNA片段为：上游5′-CCAC-GAGUCAAACCUUUAUTT-3′；下游5′-AUAAAGGU UUGACUCGUGGTT-3′。

1．4RT-PCR法观察LSD1 siRNA对Molt-4细胞LSD1 mRNA表达的影响 设定阴性对照组、0、30、60、120 nmol·L－1LSD1 siRNA处理组。每孔总体积为2 mL。37℃、5%CO2饱和湿度下培养48 h后，根据TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度法鉴定、定量，A260／A280比值均为1.8～2.0，经逆转录为cDNA。以反应所得cDNA进行PCR扩增。将β-actin（上游引物：5′-GAGACCTTCA AGAC-CCCAGCC-3′，下游引物：5′-TCGGGGCATCGGAAC-CGCTCA-3′）与LSD1引物按1∶2的比例混合。PCR反应条件：95℃5 min（预变性），95℃45 s（变性），61℃45 s（退火），72℃45 s（延伸），40个循环，最终延伸72℃10 min。将PCR产物与上样缓冲液以5∶1混合后，16 g·L－1琼脂糖凝胶电泳，于凝胶图像分析仪上自动分析成像，观察效果最佳LSD1 siRNA片段对Molt-4细胞LSD1 mRNA表达的影响。

1．5MTS法绘制细胞的生长曲线 取3个96孔板，每个96孔板中接种Molt-4细胞2×104个／孔，分别加入适量的LSD1 siRNA使终浓度分别为0、30、60、120 nmol·L－1，终体积为100 μL。每组设6个平行孔，转染后置于5%CO2饱和湿度、37℃的孵箱中继续培养。于24、48、72 h分别收获一个板内的4组细胞。将MTS和PMS按20∶1的体积比混合成混合液，每孔加20 μL的上述混合液，继续培养4 h，震荡10 min，充分溶解结晶物，在酶标仪上测吸光度即OD值（单波长492 nm），记录试验结果，并计算细胞增殖率。细胞增殖率／%＝（OD实验－OD空白）／（OD对照－OD空白）×100%。以细胞增殖率为纵轴、时间为横轴绘制细胞增殖曲线。实验重复3次。

1．6流式细胞仪检测细胞早期凋亡 LSD1 siRNA使终浓度分别为0、30、60、120 nmol·L－1，分别培养48 h后离心收集细胞，在流式细胞仪检测细胞凋亡率，方法及步骤参照BD公司试剂盒说明书进行。实验重复3次。

1．7Western blot检测干扰后LSD1蛋白、凋亡相关蛋白、p15蛋白、组蛋白H3K4一、二甲基化、H3K9甲基化、H3乙酰化状态及DNA甲基化酶DNMT1的表达 用不同浓度的LSD1 siRNA处理Molt-4细胞48 h后，收集细胞，用PBS洗涤后，调整细胞数为1×106的浓度，加入裂解液与酶抑制剂（100∶1）100 μL充分裂解细胞；低温（4℃）12 000 r ·min－1离心15 min，吸取中间清亮层，收集蛋白，BCA法进行蛋白定量，－20℃保存备用。取备用蛋白，以12%SDS-PAGE电泳分离，电转移法转膜，室温下摇床封闭1 h；加入用TBS稀释的一抗4℃过夜，TBS洗涤液洗膜后分别加入二抗，室温下孵育1 h，TBS洗膜后加入化学发光工作液，在X射线胶片（KODAK）上曝光，以β-actin为内参，用AlphaDigi-Doc图像分析软件进行分析比较。

1．8统计学分析 采用SPSS 13.5统计学软件进

行结果处理，常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据采用±s表示，并进行单因素方差分析。

2　结果

2．1LSD1 siRNA下调LSD1 mRNA及其蛋白的表达 分别将浓度为0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1-2045 RNAi片段转染Molt-4细胞，48 h后提取细胞的mRNA进行RT-PCR试验。如Fig 1A所示，LSD1 siRNA转染后LSD1 mRNA受到抑制，且与浓度相关。各组LSD1 mRNA条带灰度值与β-actin比值分别为：0.967±0.124、0.302±0.083、0.153± 0.082、0.091±0.024，各组与β-actin比值统计学处理，P＜0.05（Fig 1A）。与对照组相比，经LSD1 RNA干扰后，LSD1蛋白的表达量随着siRNA作用浓度的增加而逐渐减少，其中120 nmol·L－1组减少最明显，下降了67.67%（Fig 1B）。

Fig 1 Transfection of LSD1 siRNA in Molt-4 cells

2．2LSD1 siRNA抑制Molt-4细胞增殖 经终浓度分别为0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1 siRNA作用24、48、72 h后，Molt-4细胞的增殖率变化见Fig 2，随LSD1 siRNA浓度的增加和时间的延长，增殖率逐渐下降，呈现浓度和时间依赖性。

2．3LSD1 siRNA诱导Molt-4细胞凋亡 经30、60、120 nmol·L－1的LSD1 siRNA处理48 h后，Molt-4细胞的凋亡率分别为（12.16±1.74）%、（32.74±2.47）%、（54.64±2.58）%，而对照组为（3.35±1.26）%，细胞的凋亡率随着LSD1 siRNA浓度的增加逐渐上升（P＜0.05）。LSD1 siRNA浓度与凋亡率有明显的量效关系（Fig 3）。

2．4LSD1 siRNA对Molt-4细胞的凋亡相关蛋白、DNMT1及p15的影响 经终浓度分别为0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1的siRNA转染Molt-4细胞48 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达随着LSD1 siRNA终浓度的增加而逐渐减少，分别比对照组减少33.70%、55.62%、79.78%；procaspase-3随着siRNA处理浓度的增加表达量也逐渐下降，分别比对照组减少33.69%、54.35%、77.17%；同时，随着siRNA处理浓度的增加，抑癌基因p15的表达量逐渐增加，分别比对照组增加1.21倍、2.71倍、4.58倍；而DNMT1蛋白的表达则逐渐减弱，分别比对照组减少22.47%、71.35%、88.76%（P＜0.05）（Fig 4）。

Fig 2 Deceased cell proliferation of Molt-4 cells after transfected with LSD1 siRNA in different concentrations and in different time

Fig 3 Induction of cells apoptosis after transfected with LSD1 siRNA Molt-4 cells for 48 hours

2．5LSD1 RNAi对Molt-4细胞组蛋白甲基化和乙酰化的影响 LSD1 siRNA终浓度为30、60、120 nmol·L－1处理Molt-4细胞48 h后，组蛋白H3K4

一甲基化和二甲基化表达随siRNA浓度增加而增强；组蛋白H3K4三甲基化水平不变；组蛋白H3K9一甲基化和二甲基化水平也几乎不变；组蛋白H3乙酰化水平随siRNA浓度增加而表达增强（Fig 5）。

Fig 4 Alteration of apoptosis-related protein and DNMT1，p15 protein in Molt-4 cells after transfected with indicated concentrations of LSD1 siRNA for 24 h

3　讨论

一般认为，肿瘤的发生与癌基因的异常激活或过度表达有关，而抑癌基因的失活也可能使细胞向恶性转化。表观遗传学的改变对肿瘤的发生和发展起了重要的作用。组蛋白H3K4去基化酶LSD1在表观遗传学中发挥了重要作用，其在多种肿瘤表达异常，说明它对肿瘤的发生有关。本研究以RNA干扰技术削减急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞的LSD1表达，观察白血病细胞的表观遗传学的变化及增殖、凋亡的影响，探讨LSD1作为抗肿瘤靶点的可能性。

特异性地诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。2010年Kontaki等［6］首先报告当DNA损伤时，set和LSD1分别对E2F1-K185me进行去甲基化修饰，使其更远的乙酰化和磷酸化，它主要作用于细胞周期的G1期到S期的过渡，并通过激活p53、p73等辅助因子，即p53依赖和非p53依赖细胞凋亡通路，激活大量凋亡前基因。本研究结果显示，LSD1 siRNA干扰LSD1基因后可促进Molt-4细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-3裂解，触发细胞凋亡，细胞凋亡率随着LSD1 siRNA浓度的增加逐渐上升（P＜0.05）；Wang等［7］鉴定出DN-MT1是LSD1的新底物。DNMT1可被LSD1去甲基化，引起DNA甲基化的失衡。p15（Ink4b）基因属于抑癌基因中周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CK-Is）第二大家族，通过抑制CDK4／6，从而抑制Rb蛋白磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而减少细胞的异常生长及变异，阻止肿瘤发生和发展。沉默LSD1基因可下调DNA甲基转移酶1（DNMT1），使抑癌基因p15去甲基化而表达上调，从而抑制肿瘤细胞增殖。

Fig 5 Alteration of histone methylation and acetylation modification of Molt-4 cells after transfection with indicated concentrations of LSD1 siRNA for 24 h

本研究还发现沉默LSD1后，H3K4的一甲基化和二甲基化水平逐渐增强，组蛋白H3乙酰化水平上调，而H3K4的三甲基化及H3K9的一甲基化和二甲基化未发生改变。Shi等［1］和Nicholson等［8］的实验显示在FAD的参与下，LSD1在体外可以特异去除组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4）的二甲基和一甲基修饰。而三甲基则需要亚胺阳离子中间体才能介导对H3K4三甲基的去甲基化反应。LSD1不

是H3K9去甲基化酶，但有文献报告LSD1可在体内才能去除H3K9的二甲基和一甲基修饰［9］。Miao等［10］研究发现：组蛋白H3-K4Me2、H3-K4Me3、H3-K36Me2和H3-K79Me2与高度乙酰化和基因激活都有关系。因此，可以推导出：当组蛋白H3-K4Me2表达增加时，可引起组蛋白高度乙酰化，从而使组蛋白H3乙酰化增加。

本研究提示干扰LSD1基因后肿瘤细胞发生表观遗传学改变，进而促使细胞凋亡，肿瘤细胞受到抑制，有望成为肿瘤治疗的靶点。

（致谢：本文实验在闽南师范大学生物科学院中心实验室完成，感谢实验室的老师对本实验的支持。）

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［3］ Naqasawa S，Sedukdina A S，Nakaqawa I，et al．LSD1 overex-pression is associated with poor prognosis in basal-like breast canc-er，and sensitivity to PARP inhibition［J］．PLos One，2015，10 （2）：e0118002．

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［5］ Lei Z J，Wang J，Xiao H L，et al．Lysine-specific dem ethylase 1 promotes the stemness and chemoresistance of Lgr5＋liver cancer initiating cells by suppressing negative regulators of β-catenin sig-naling［J］．J Oncogene，2015，34：3188－98．

［6］ Kontaki H，Talianidis I．Lysine methylation regulates E2F1-in-duced cell death［J］．J Molell，2010，39（1）：152－60．

［7］ Wang J，Hevi S，Kurash J K，et al．The lysine demethylase LSD1 （KDM1）is required for maintenance of global DNA methylation ［J］．J Nat Genet，2009，41（1）：125－9．

［8］ Nicholson T B，Chen T．LSD1 demethylates histone and non-his-tone proteins［J］．J Epigenetics，2009，4（3）：129－32．

［9］ Lan F，Nottke A C，Shi Y．Mechanisms involved in the regulation of histone lysine demethylases［J］．J Curr Opin Cell Biol，2008，20 （3）：316－25．

［10］Miao F，Natarajan R．Mapping global histone methylation patterns in the coding regions of human genes［J］．J Mol Cell Biol，2005，25（11）：4650－61．

Effects of silencing LSD1 gene on Molt-4 cells apoptosis

XU Ke-zhen1，HUANG Yi-qun2，HUANG Xiu-wang3，MA Xu-dong2
（1．Dept of Pharmacy，2．Dept of Hematology，Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Zhangzhou Fujian 363000，China；3．School of Pharmacy，Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China）

Abstract：Aim To observe the effect of the LSD1 gene on the proliferation and apoptosis of Molt-4 cells，a kind of human acute T-lymphoblastic leukemia cells．Methods siRNA fragment based on LSD1 gene was designed，filtered out and then transfected into Molt-4 cells．The effects of LSD 1 siRNA on Molt-4 cell prolif-eration were observed by the method of MTS．The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry．The states of histone H3K4，H3K9 methylation，histone H3 acetyla-tion，p15，DNA methyltransferase 1（DNMT1），and apoptosis-related proteins like Bcl-2，procaspase-3 were evaluated by Western blot．Results Silencing LSD1 gene inhibited cell proliferation．Molt-4 cell pro-liferation rate was（99.65±1.21）%，（83.02± 1.69）%，（65.72±2.16）%，and（41.15±2.23）% respectively after the treatment of Molt-4 cells with 0，30，60，120 nmol·L－1of LSD1 siRNA after 48 hours （P＜0.05）．Cell proliferation rate was（99.86± 1.35）%，（65.72±2.16）%，（48.26±1.92）%，and （37.86±1.66）%respectively after the transfection of Molt-4 cells with 60 nmol·L－1of LSD1 siRNA after 0，24，48，72 hours（P＜0.05）．Cell apoptosis rate was（3.35±1.26）%，（12.16±1.74）%，（32.74 ±2.47）%，（54.64±2.58）%respectively after transfection of LSD1 siRNA in indicated concentrations for 48 hours（P＜0.05）．At the same time，the ex-pression levels of apoptosis-related proteins like Bcl-2，procaspase-3 decreased．LSD1 siRNA inhibited LSD1 and LSD1 mRNA，and accumulated histone mono-，and di-methylation H3K4 and histone H3 acetylation．However，alteration of H3K4 trimethylation，H3K9 methylation was not detected．LSD1 siRNA downregu-lated DNA demethylase DNMT1 and upregulated p15．Conclusions LSD1 siRNA can inhibit Molt-4 cell proliferation and induce apoptosis．Its mechanism may be associated with epigenetic regulation．In addition，it is expected to become a new target for leukemia treat-ment．

Key words：acute leukemia；LSD1；histone；methyla-tion；acetylation；epigenetics

作者简介：许可珍（1979－），女，硕士，主管药师，研究方向：临床药学，Tel：0596-2082381，E-mail：xkz868＠163．com；马旭东（1957－），女，硕士，主任医师，教授，博士生导师，研究方向：血液肿瘤学，通讯作者，Tel：0596-2082021，Fax：0596-2593904，E-mail：maxudong005＠hotmail．com

基金项目：福建省自然科学基金资助项目（No 2012J01420）；漳州市科学研究发展计划基金资助项目（No 20100080）；福建省引进重大项目计划基金（No 2012I2004）；福建医科大学重点科研项目（No FZS13004Z）；福建省医学创新课题（No 2012-CX-32）

收稿日期：2015－06－13，修回日期：2015－07－15

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）11－1603－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．024