白藜芦醇降低ox-LDL诱导血小板ROS产生和PECAM-1表达的分子机制研究

孙 杰，孙文佳，陈北冬，赵艳阳，鲍 利，吴 伟，齐若梅

（北京医院／北京老年医学研究所，卫计委老年医学重点实验室，北京 100730）

白藜芦醇降低ox-LDL诱导血小板ROS产生和PECAM-1表达的分子机制研究

孙 杰，孙文佳，陈北冬，赵艳阳，鲍 利，吴 伟，齐若梅

（北京医院／北京老年医学研究所，卫计委老年医学重点实验室，北京 100730）

中国图书分类号：R284．1；R331．124；R392．11；R345.57；R543.5

摘要：目的 探讨白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板的ROS产生和PECAM-1表达的影响以及相关的分子机制。方法 用ox-LDL刺激血小板，应用Western blot检测PECAM-1、Sirt1的表达以及p38MAPK的磷酸化。用荧光试剂盒检测ROS水平。结果 ①ox-LDL刺激血小板时聚集率为14%，100 μmol·L－1白藜芦醇抑制了血小板聚集，抑制率为50%。②白藜芦醇减少了ox-LDL诱导的ROS产生约3．2倍，并抑制了PECAM-1表达。③ox-LDL刺激血小板时Sirt1表达降低，白藜芦醇（100 μmol·L－1）逆转了这一现象。Sirt1抑制剂EX527增加了血小板ROS水平和PECAM-1表达。④白藜芦醇抑制了ox-LDL刺激的p38MAPK磷酸化。结论 白藜芦醇能够降低ox-LDL诱导的血小板聚集、抑制ROS产生，以及降低PECAM-1的表达，其分子机制与增加Sirt1的表达相关。此外，白藜芦醇抑制PECAM-1表达与抑制p38MAPK磷酸化相关。

关键词：白藜芦醇；ox-LDL；血小板；ROS；PECAM-1；Sirt1；p38MAPK

网络出版时间：2015－10－16 9：52 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．050．html

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病变是一种复杂的慢性血管炎症性疾病，血管壁的内皮细胞、平滑肌细胞、炎症细胞和血小板功能均有改变［1］。机体的增龄变化、有害代谢产物的堆积以及氧化应激产物增加，均是导致动脉粥样硬化的危险因素。大量研究显示ox-LDL能够损伤血管内皮细胞，促进与动脉粥样硬化的发生［2－3］。ox-LDL能够刺激血小板活化，促进血栓形成。活化的血小板通过释放细胞因子等炎症蛋白，促进动脉粥样硬化的血管炎症反应。

白藜芦醇（resveratrol，RSV）是多酚类物质，在葡萄籽和红酒中有较高的含量。研究发现［4－5］，RSV是天然的抗氧化剂，具有增加细胞内保护分子Sirt1表达，抗炎和抑制血栓形成的作用。Sirt1是近年来医学研究十分关注的细胞内源性保护性分子，在调节细胞能量代谢与长寿中起十分重要的作用［6］。动物实验研究表明，限制小鼠热量摄取，能够降低小鼠的能量代谢水平，增加Sirt1的表达，延长小鼠寿命［7］。很多研究已经确认Sirt1与机体长寿相关，是一个长寿基因［8－9］。研究也证实RSV是Sirt1的激动剂，RSV能够增加细胞内Sirt1表达，减轻有害刺激对细胞的损伤，具有多种生物学保护作用。然而，RSV是否能够抑制ox-LDL刺激的血小板活化尚不清楚。本研究重点观察了RSV对ox-LDL诱导的血小板聚集、ROS产生、以及PECAM-1表达的影响，并对相关的分子机制进行了探讨。

1　材料与方法

1．1药品与试剂 白藜芦醇购自Sigma公司，纯度为99%（货号：R5010）。抗PECAM-1、抗β-actin抗体购自Santa Cruz公司；抗Sirt1抗体购自Millipore公司；抗p38MAPK和抗phospho-p38MAPK抗体购自Cell Signaling公司。辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、兔抗山羊二抗购自北京中杉金桥公司。活性氧检测试剂盒（S0033）购自碧云天生物技术有限公司。

1．2ox-LDL的制备 收集新鲜人血清，用梯度超速离心法分离低密度脂蛋白。使用5 μmol·L－1硫酸铜氧化低密度脂蛋白，37℃，10 h，加入1 mmol· L－1EDTA终止氧化反应。然后用PBS（pH 7.3）4℃透析24 h。用0.22 μm的Millex滤器过滤，用BCA法测定LDL蛋白浓度，4℃储存。

1．3制备洗涤血小板 取健康正常人血液，1 200 r ·min－1离心10 min，分离上清，得到富血小板血浆。加入TYRODE Buffer（138 mmol·L－1NaCl，3.3 mmol·L－1NaH2PO4，2.9 mmol·L－1KCl，1 mmol ·L－1MgCl2，5.5 mmol·L－1glucose，20 mmol· L－1HEPES，pH 7.2）和9∶1的ACD（2.5%trisodi-um citrate，2.0%glucose，1.5%citric acid），2 mmol

·L－1EDTA，混匀，1 400 r·min－1离心10 min。弃上清，悬浮细胞。再次离心，获得洗涤血小板。将血小板悬浮液室温静置30 min后，进行实验。

1．4血小板聚集测定 使用Chrono-Log血小板聚集分析仪测定血小板聚集，血小板聚集率由血小板聚集分析仪的软件计算。取血小板悬浮液300 μL置于测定通道内，搅拌1 min，加入ox-LDL（0.1 g· L－1）刺激血小板10 min；药物干预组将100 μmol ·L－1RSV孵育血小板10 min，放入测定通道。搅拌1 min，再加入ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激血小板10 min，终止反应，获得血小板聚集曲线。

1．5活性氧（ROS）测定 使用活性氧检测试剂盒，将荧光探针DCFH-DA（1∶1 000）孵育血小板，37℃，30min，洗涤血小板3次。血小板细胞内的荧光强度用CARY Eclipse荧光分光光度计测定，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。阳性对照组用ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激细胞10 min，药物处理组用100 μmol·L－1RSV孵育血小板10 min，再加入ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激细胞10 min，开始测定荧光强度。

1．6Western blot方法检测蛋白表达 分别用各种浓度的RSV（1、10、100 μmol·L－1）、p38MAPK抑制剂SB203580（0．1、0．3、1 μmol·L－1）以及Sirt1抑制剂EX527（10、30、100 nmol·L－1）预孵育血小板10 min，加入ox-LDL（0．1 g·L－1）刺激血小板10 min，终止反应。采用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温下封闭PVDF膜2 h，洗膜3次。分别加入特异性抗体（PECAM-1、Sirt1、p38MAPK、phospho-p38MAPK、β-actin），4℃，过夜。用TBS-T（100 mmol·L－1Tris，150 mmol·L－1NaCl，0．1%Tween，pH 7.2）洗膜3次，每次5 min。加入相应二抗（1∶10 000），室温孵育2 h。用TBS-T洗膜4次，每次5 min。最后，加入ECL发光液，用凝胶成像仪成像。

1．7统计学方法 所有数据来源于至少4次独立的实验，数据以±s表示，采用双尾单因素方差分析以及Student t检验。

2　结果

2．1白藜芦醇对血小板聚集的影响 血小板聚集分析显示，ox-LDL（0．1 g·L－1）刺激血小板诱导了轻度的血小板聚集，聚集率为14%（Fig 1A），而使用100 μmol·L－1白藜芦醇孵育10 min血小板后，血小板聚集受到抑制，聚集率为7%（Fig 1B）。白藜芦醇的血小板聚集抑制率为50%，两组之间存在明显差异，差异具有统计学意义（P＜0．05）（Fig 1C）。

2．2白藜芦醇对ox-LDL诱导的血小板ROS产生的影响 ox-LDL为氧化型脂质产物，能够诱导细胞的氧化应激及炎症反应。结果显示，ox-LDL（0.1 g ·L－1）刺激血小板ROS产生增加了11.5倍，与正常对照组比较，两组之间差异具有统计学意义，P＜0.05。白藜芦醇处理的血小板与ox-LDL组比较，ROS产生减少了3.2倍，两组之间差异具有统计学意义，P＜0.05（Fig 2）。

2．3白藜芦醇对ox-LDL诱导的血小板PECAM-1表达的影响 Platelet endothelial cell adhesion mole-cule-1（PECAM-1）是血小板内皮细胞黏附分子，在血管内皮细胞损伤时促进血小板与内皮细胞的黏附反应。结果显示，ox-LDL刺激血小板后PECAM-1表达增加，而白藜芦醇以剂量依赖的方式抑制了PECAM-1表达，与ox-LDL组比较，二者差异具有统计学意义（Fig 3）。

Fig 1 Effect of RSV on platelet aggregation induced by ox-LDL

Fig 2 Effects of RSV on ROS production in ox-LDL-stimulated platelets

Fig 3 Effects of RSV on PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

Fig 4 Effects of RSV on Sirt1 expression in platelets

2．4白藜芦醇对ox-LDL诱导的血小板Sirt1表达的影响 研究已经提示白藜芦醇是Sirt1的激活剂，本研究观察了白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板活化时Sirt1的变化。当ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激血小板时Sirt1的表达下降了18%，与对照组比较，两组之间差异具有统计学意义，P＜0.05。与ox-LDL组比较，白藜芦醇（1、10、100 μmol·L－1）以浓度依赖的方式恢复了Sirt1的表达（Fig 4A）。此外，我们观察白藜芦醇单独处理对血小板Sirt1表达的影响。结果显示，各种浓度的白藜芦醇（1、10、100 μmol· L－1）孵育血小板10 mim，各组细胞Sirt1的表达没有明显变化（Fig 4B）。这一结果提示，ox-LDL刺激

血小板时保护性分子Sirt1受到损伤，出现了表达降低的变化，而白藜芦醇能够逆转这一现象。

2．5EX527对ox-LDL诱导的血小板ROS水平及PECAM-1表达的影响 EX527是Sirt1特异性抑制剂，为了分析白藜芦醇抑制ox-LDL刺激血小板ROS产生及PECAM-1表达是否与Sirt1相关，以及Sirt1是否调控ROS产生及PECAM-1表达。我们使用了不同浓度的EX527（10、30、100 nmol·L－1）处理血小板。结果显示，在一个高浓度100 nmol·L－1EX527处理的血小板ROS产生明显增加，与ox-LDL刺激组比较，二组之间差异具有统计学意义（P ＜0.05）（Fig 5A）。同样EX527处理的血小板PE-CAM-1表达也明显增加（P＜0.05）（Fig 5B，C）。这一结果提示，病理条件下增加的ROS产生以及PE-CAM-1表达可能与Sirt1表达／活性降低相关联。

2．6白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板p38MAPK磷酸化的影响 先前的研究表明，p38MAPK参与多种血小板诱导剂刺激的血小板活化，如胶原（colla-gen）、凝血酶（thrombin）和ADP［10］。本研究我们观察了ox-LDL刺激血小板后p38MAPK的影响。结果显示，ox-LDL刺激血小板后p38MAPK磷酸化水平增加了2．4倍，与对照组比较有明显差异（P＜0.01）。白藜芦醇（100 μmol·L－1）明显抑制了p38MAPK的磷酸化（P＜0.05）（Fig 6）。

2．7SB203580对ox-LDL诱导的血小板ROS产生及PECAM-1表达的影响 为了确认白藜芦醇降低ROS产生以及PECAM-1表达的药理作用是否与抑制p38MAPK相关，我们使用p38MAPK的抑制剂SB203580，分析其对ox-LDL刺激血小板ROS产生和PECAM-1表达的影响。我们在预实验中确认1 μmol·L－1SB203580能够完全抑制p38MAPK磷酸化。结果显示，1 μmol·L－1SB203580不能抑制ox-LDL刺激的血小板ROS产生（Fig 7A）。进一步，我们观察了SB203580对PECAM-1的影响。结果显示，与ox-LDL组比较，SB203580（0.1、0.3、1 μmol· L－1）明显抑制了ox-LDL刺激血小板PECAM-1的表达，两组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig 7B，C）。这一结果提示，p38MAPK参与调控PE-CAM-1表达，但对ROS产生无明显影响。白藜芦醇抑制ox-LDL诱导血小板过表达PECAM-1可能与抑制p38MAPK磷酸化相联系。

3　讨论

Fig 5 Effects of EX527 on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

血小板活化在动脉粥样硬化血栓形成中是一个关键的环节，然而，近年大量研究显示，血小板在动脉粥样硬化的早期炎症过程中通过释放炎症介质，促进动脉粥样硬化的血管炎症。机体脂质代谢失调导致血脂成分增加，循环中的ox-LDL增加，不仅损伤内皮细胞，同时也能影响血小板功能。最近，我们以及其他的研究均证实，ox-LDL能够使内皮细胞炎症蛋白表达增高，也能促进血小板的聚集。因此，抑制ox-LDL损伤内皮细胞和血小板活化，对于防治动脉粥样硬化血管炎症和血栓形成具有重要意义。血小板是由骨髓巨核细胞脱落而成的无核细胞，近年研究发现，血小板有丰富的mRNA存在，具有合成蛋白的能力。最近，Denis等［11］报告，血小板含有剪

接体和小核RNA以及mRNA前体，在血小板活化时能够转化为成熟mRNA，促进血小板炎症蛋白表达。我们的结果也证实血小板活化时炎症蛋白表达增加。

Fig 6 Effects of RSV on p38MAPK phosphorylation in ox-LDL-stimulated platelets

白藜芦醇又称为芪三酚，主要来源于葡萄、虎杖、桑椹等植物，具有抗氧化及抗炎的作用。动物实验提示［12］，白藜芦醇能够改善高热量高胆固醇饮食引起的内皮损伤。白藜芦醇的抗氧化作用可能与增加细胞内Sirt1表达相关［13－14］。在体实验研究表明，通过热量限制和运动等方式可以促进Sirt1表达［15］。然而，Sirt1对血小板功能的调控尚不清楚。我们的结果提示，白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激的血小板聚集，降低血小板ROS产生和PECAM-1表达，这些药理作用与增加血小板Sirt1表达相关。

Fig 7 Effects of SB203580 on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

p38MAPK为MAPK家族的重要成员，不仅参与细胞的生存、分化和凋亡，还在炎症、氧化应激反应中起有重要作用。研究发现［16］，白藜芦醇可以抑制巨噬细胞的凋亡，与p38MAPK通路有关。我们的结果显示，抑制p38MAPK磷酸化能够减少ox-LDL刺激血小板炎症蛋白PECAM-1表达，但对ox-LDL诱导的ROS产生无明显抑制作用。在生理条件下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）作为第二信使，参与细胞代谢，保持正常的细胞功能。然而，过高水平ROS能够导致细胞发生氧化应激反应。因此，ROS也被认为是氧化应激反应的病理产物和动脉粥样硬化的危险因素［17－18］。本研究发现，ox-LDL刺激血小板之后，血小板发生聚集，ROS水平随之升高，而白藜芦醇部分地降低了ROS水平。由于细胞内ROS产生的途径较复杂，线粒体代谢、花生四烯酸代谢、nicotinamide adenine dinucleotide phos-phate（NADPH）等均是ROS的重要来源。我们的结果提示尽管白藜芦醇减少ROS产生，但抑制效果

是不完全的，确切的分子机制还有待于进一步研究。

综上所述，白藜芦醇能够降低ox-LDL诱导的血小板聚集、减少ROS产生，并降低PECAM-1的表达。其分子机制与增加Sirt1的表达相关。此外，白藜芦醇抑制PECAM-1表达与抑制p38 MAPK磷酸化相关。本研究提出了白藜芦醇改善血小板功能的实验依据，对临床预防治疗血栓性疾病，改善血管细胞功能具有重要的参考价值和科学意义。

（致谢：本文在北京老年医学研究所免疫室完成，在此加以致谢！）

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Effect of resveratrol on ROS production and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets

SUN Jie，SUN Wei-jia，CHEN Bei-dong，ZHAO Yan-yang，BAO Li，WU Wei，QI Ruo-mei （Beijing Hospital／Beijing Institute of Geriatrics，Beijing 100730，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of resveratrol on ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets．Methods The expression of PE-CAM-1，Sirt1 and p38MAPK phosphorylation in ox-LDL-stimulated platelets was determined by Western blot．The level of ROS was measured by immunofluo-rescence kit．Results ox-LDL induced platelet aggre-gation by 14%，whereas resveratrol inhibited platelet aggregation by 50%．Resveratrol decreased ROS level by 3．2 fold and completely suppressed PECAM-1

expression in ox-LDL-treated platelets．Resveratrol re-covered Sirt1 expression in ox-LDL-treated platelets．EX527（a Sirt1 inhibitor）increased ROS level and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets．Meanwhile，resveratrol also suppressed p38MAPK phosphorylation induced by ox-LDL．Conclusion Resveratrol can inhibit platelet aggregation，decrease ROS production and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets．The mechanism maybe associated with recovery of Sirt1 expression．Moreover，resveratrol can decrease PECAM-1 expression，which may be linked to abolishing p38MAPK phosphorylation．

Key words：resveratrol；ox-LDL；platelets；ROS；PE-CAM-1；Sirt1；p38MAPK

作者简介：孙 杰（1990－），女，硕士生，研究方向：心血管疾病相关的基础研究，Tel：010-58115047，E-mail：cdmcsj＠126．com；齐若梅（1957－），女，博士，研究员，博士生导师，研究方向：动脉粥样硬化、血栓学的分子机制，通讯作者，Tel：010-58115047，E-mail：ruomeiqi＠163．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81270379，81471051）

收稿日期：2015－07－17，修回日期：2015－08－05

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）11－1608－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．025