胰岛素样生长因子结合蛋白5与汉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖的关系研究

王东旭，袁霜雪，伍秋香，任春美，陈振华，顾格瑜，李绍春，孙文娟，吴 柯，何百成

（重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆医科大学药理教研室，重庆 400016）

胰岛素样生长因子结合蛋白5与汉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖的关系研究

王东旭，袁霜雪，伍秋香，任春美，陈振华，顾格瑜，李绍春，孙文娟，吴 柯，何百成

（重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆医科大学药理教研室，重庆 400016）

中国图书分类号：R284.1；R329.24；R329.25；R735.350.22；R977.6

摘要：目的 研究汉防己甲素（tetrandrine，Tet）抑制结肠癌细胞增殖作用及其可能的分子机制。方法 采用结晶紫染色和流式细胞术检测不同浓度Tet对结肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用。采用流式细胞术分析Tet对LoVo细胞凋亡的促进作用。利用Western blot检测Tet对IGFBP-5的表达影响。采用荧光素酶报告质粒，IGFBP5以及IGFBP5 siRNA的重组腺病毒，研究Tet抑制结肠癌细胞增殖的分子机制。结果 Tet能明显抑制LoVo细胞增殖，并能诱导G1期阻滞，同时促进LoVo细胞凋亡。Tet呈浓度依赖性降低LoVo细胞中IGFBP5的表达水平。与对照组相比，Tet明显抑制TOP-luc报告质粒的转录活性，外源性过表达IGFBP5能部分逆转这种抑制作用；Tet明显下调LoVo细胞中c-Myc表达水平，外源性过表达IGFBP5能部分逆转，但沉默IGFBP5表达不能逆转Tet对c-Myc表达水平的抑制作用。结论 Tet能抑制结肠癌细胞LoVo的增殖，并诱导凋亡，这种作用可能与Tet通过下调IGFBP5表达进而抑制Wnt／β-catenin信号有关。

关键词：汉防己甲素；结肠癌；增殖抑制；细胞凋亡；IGFBP5；Wnt／β-catenin信号

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．032．html

汉防己甲素（tetrandrine，Tet）又名汉防己碱，属于二苄基异喹啉类生物碱，来源于传统中药防己科植物粉防己（汉防己，Stephaniatetrandra S．Moore）的干燥根。近年研究显示，Tet能抑制多种肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，如肝癌、乳腺癌和结肠癌等，但该作用的具体分子生物学机制目前仍不十分清楚［1－3］。

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，具有较高发病率和致死率。目前，结肠癌的诊断和治疗水平都有了较大提高，但其治疗效果及预后仍不十分乐观。因此，寻找新的药物靶点或开发新的治疗药物是目前攻克结肠癌所面临的主要挑战之一。研究表明，胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor，IGF）信号通路与结肠癌发生关系密切［4－6］，可能是结肠癌治疗潜在的有效靶点之一［7］。

IGFBP-5对IGF信号具有重要调节作用。文献报道，IGFBP-5与多种肿瘤细胞的增殖和凋亡有关，如乳腺癌、肝癌和骨肉瘤等［8-10］。但是，IGFBP-5对肿瘤细胞的作用存在争议：既可以抑制肿瘤细胞生长，也可以促进肿瘤细胞生长。Tet对结肠癌细胞的增殖具有明显抑制作用［2］，但目前仍不清楚IGFBP5是否与这种作用有关。

本研究主要分析IGFBP5与Tet抑制结肠癌细胞的增殖关系。旨在进一步深诠释Tet抑制结肠癌细胞增殖的分子机制，为将Tet用于结肠癌的治疗提供实验和理论依据。

1　材料与方法

1．1试剂及细胞培养 汉防已甲素购自Sigma-Aldrich公司。人结肠癌LoVo细胞购自ATCC（A-merican Type Culture Collection）。实验所用IGFBP-5 和c-Myc等一抗均购自Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。采用DMEM培养基（高糖）进行细胞培养（10%的胎牛血清、100 kU·L－1青霉素以及0.1 g·L－1链霉素），培养条件为5%的CO2和37℃。

1．2构建重组腺病毒 本研究所用重组腺病毒采用AdEasy系统构建［11］，简述如下：以EST克隆为模板，采用PCR将目的基因编码序列扩增（或人工合成的siRNA片段）并克隆到穿梭质粒。最后，将穿梭质粒线性化，并与骨架质粒进行同源重组，将重组正确的质粒线性化后转染HEK-293细胞（human embryonic kidney-293）进行病毒包装，得到含目的基因编码序列的重组腺病毒载体。包括绿色荧光蛋白重组腺病毒（AdGFP）、IGFBP5重组腺病毒（AdIGFBP5）和IGFBP5的siRNA重组腺病毒（AdsiIGFBP5）。

1．3结晶紫染色实验 将指数生长的LoVo细胞均匀种于24孔板中，按实验设计用相应浓度的Tet处理细胞。在相应时间点进行结晶紫染色，分析细胞的增殖情况。方法简述如下［3］：弃培养基，用PBS小心清洗孔板。然后，每孔加入500 μL结晶紫饱和溶液（采用PBS缓冲的10%甲醛配制），在室温下孵育20 min。最后，弃结晶紫染液，并且用自来水小心将孔板清洗干净。室温下将孔板晾干，并用扫描仪扫描。用20%的乙酸溶液溶解结晶紫，并通过酶标仪测定吸光度以便进行定量分析，测定波长为590 nm。每组实验重复3次。

1．4Western blot实验 将指数生长的LoVo细胞均匀种于6孔板，等细胞贴壁后按实验设计加入相应处理因素。于处理后24 h和（或）48 h提取总蛋白，并用BCA法测定各组总蛋白浓度。采用SDS-PAGE法进行Western blot操作，采用ECL化学发光法显影并成像。每组实验重复3次。

1．5凋亡检测实验 将处于指数生长期的LoVo细胞均匀种于6孔板，待细胞贴壁后按实验设计加入相应处理因素。48 h后收集培养基及贴壁的细胞并用PBS（4℃）清洗；利用Annexin V-EGFP和PI进行孵育（按试剂盒说明进行操作），然后通过流式细胞仪进行凋亡检测。每组实验重复3次。

1．6周期检测试验 将处于指数生长期的LoVo细胞均匀种于6孔板，贴壁后按要求加入相应处理因素。48 h后，小心弃去培养基，收集细胞并用PBS （4℃）清洗，通过流式细胞仪进行细胞周期分析（按试剂盒的操作说明进行）。每组实验重复3次。

1．7萤光素酶报告质粒检测实验 将指数生长状态的LoVo细胞种于T25培养瓶中，贴壁后用Lipo-fectamine2000转染LEF／TCF4报告质粒（pTOP-Luc）3 μg，4 h后换液。12 h后将细胞收集并重新种于24孔板中，并分别用不同浓度的Tet处理。24 h后，弃培养基并裂解细胞，按试剂盒操作说明测定萤光素酶活性。用BCA法测定裂解液总蛋白浓度，用于标准化萤光素酶活性。每组实验重复3次。

2　结果

2．1Tet明显抑制结肠癌LoVo的增殖 结晶紫染色结果显示，Tet能有效地抑制LoVo细胞增殖，并且呈浓度依赖性（Fig 1A）；Tet在5 μmol·L－1时就能明显抑制LoVo细胞的增殖。流式细胞分析结果表明，与对照组相比，Tet可以诱导细胞停滞在G1期（Fig 1C）。结果提示，Tet对LoVo细胞的增殖具有抑制作用。

Fig 1 Effects of Tet on proliferation of LoVo cells

2．2Tet能促进结肠癌LoVo凋亡 本研究进一步分析Tet是否可以诱导结肠癌细胞凋亡。流式细胞仪分析结果显示，与对照组相比，加入Tet后细胞凋亡率明显增加，且凋亡细胞的百分比呈浓度依赖性增加（Fig 2A）。Western blot分析结果显示，Tet能明显增加Bad的水平，但同时降低Bcl-2的水平（48 h时最明显）。以上结果提示，Tet抑制LoVo细胞增殖与促进细胞凋亡有关。

2．3Tet抑制LoVo细胞增殖与下调IGFBP5表达有关 IGFs信号异常是肿瘤发生的重要原因之一。IGFBP5对IGFs信号具有重要调节作用，但IGFBP5与结肠癌的确切关系目前还不十分清楚。因此，本研究拟分析Tet抑制LoVo细胞增殖是否与IGFBP5有关。Western blot结果显示，Tet在LoVo细胞中可以明显降低IGFBP5的表达水平（Fig 3A）。提示，IGFBP5可能与Tet抑制LoVo细胞增殖有关。利用重组腺病毒介导的IGFBP5过表达或沉默表达进一步分析。结果显示，Tet明显导致G1期阻滞，外源性过表达IGFBP5能部分逆转Tet的G1期阻滞作用，而IGFBP5沉默表达则明显增强Tet对LoVo细胞的G1期阻滞作用（Fig 3B）；Tet明显促进LoVo细胞凋亡，外源性过表达IGFBP5明显降低Tet对LoVo细胞的凋亡促进作用，而IGFBP5沉默表达则明显增加死亡LoVo细胞的百分比（Fig 3C）。结果提示，下调IGFBP5表达可能与Tet抑制LoVo细胞增殖有关，但具体分子机制尚不清楚。

2．4IGFBP5逆转Tet对Wnt／β-catenin信号的抑制作用 Wnt／β-catenin信号异常激活是结肠癌最常见的发病原因之一。课题组前期结果显示，Tet对结肠癌细胞中的Wnt／β-catenin信号具有明显抑作用［3］。因此，本研究进一步分析，Tet下调IGFBP5表达是否与其抑制Wnt／β-catenin信号转导有关。荧光素酶报告质粒结果显示，Tet明显抑制pTOP-Luc报告质粒的转录活性，但外源性过表达IGFBP5能部分逆转Tet的作用（Fig 4A）。Western blot结果表明，Tet可以明显抑制c-Myc在LoVo细胞中表达；外源性过表达IGFBP5能明显逆转Tet对C-myc表达的抑制作用，但沉默IGFBP5表达则增强Tet的这种抑制作用（Fig 4B）。提示，IGFBP5在Tet抑制LoVo细胞增殖中的作用可能与调节Wnt／β-catenin信号转导有关。

3　讨论

汉防己甲素（Tet）属于二苄基异喹啉类生物碱，来源于传统中药防己科植物粉防己的干燥根［1］。Tet对多种肿瘤细胞具有抑制增殖和促进其凋亡的作用，如肝癌、乳腺癌和结肠癌等。本研究表明，Tet能抑制结肠癌细胞增殖，这种作用可能与Tet通过下调IGFBP5表达实现对Wnt／β-catenin信号的抑制有关，但IGFBP5对Wnt／β-catenin的调节体机制尚不清楚。

Fig 2 Effects of Tet on apoptosis in LoVo cells

IGF信号参与细胞增殖、分化和凋亡的调节，因此，该信号在胚胎和个体发育及肿瘤发生过程中具

有重要作用。IGF信号通路成员众多，包括两种多肽生长因子（IGF-1和IGF-2），细胞表面与IGFs结合的两类相应受体（IGF-1受体和IGF-2受体），7种与IGFs结合的蛋白（IGFBP1～IGFBP7），以及一系列降解IGFBPs的蛋白酶［12］。IGFBP5是IGF信号的关键调节因子之一。文献报道，IGFBP5与多种肿瘤的发生密切相关，如乳腺癌、肝癌和骨肉瘤等［8－10］。但是，IGFBP5对肿瘤细胞增殖的抑制作用存在争议：IGFBP5虽能抑制部分肿瘤细胞生长，但却能促进另外的一些肿瘤细胞生长。这种原因可能与细胞的微环境、细胞种类以及IGFBP5在胞内的定位有关，同时也与IGFBP5各结构域的功能状态有关［13－14］。本研究发现，Tet能抑制结肠癌细胞的增殖，这种作用可能与Tet下调IGFBP5的表达有关。因此，我们推测IGFBP5可能与结肠癌的发生关系密切，是结肠癌治疗的潜在靶点之一。

Fig 3 IGFBP5 associated with the anti-proliferating effects of Tet on LoVo cells

Fig 4 Effect of IGFBP5 on Wnt／β-catenin signaling repressed by Tet

Wnt信号的异常活化被认为是结肠癌发生的重要原因之一［15］。该信号参与个体胚胎发育及正常生理功能调控，根据其功能的发挥是否依赖于β-catenin而将Wnt信号分为经典Wnt信号通路与非经典Wnt信号通路。在经典的Wnt信号通路中，β-catenin对于该信号的转导具有中枢作用，故该通路

习惯上被叫作Wnt／β-catenin信号通路。当Wnt配体与胞膜上的受体卷曲蛋白（Frizzled protein，Fzds）结合后，能阻止胞质中的降解复合物（Axin-APC-GSK3β）形成，使β-catenin的泛素化降解被抑制；导致胞质内β-catenin水平升高，并转位入核，与其他相应的的转录因子结合，调节下游靶基因表达。反之，当Fzds未与Wnt配体结合时，胞质中β-catenin降解复合物形成，促使β-catenin降解，降低胞内β-catenin水平，进而抑制Wnt／β-catenin信号［16］。实验结果显示，Tet明显抑制pTOP-Luc报告质粒的转录活性，但外源性过表达IGFBP5可以部分翻转Tet的这种作用（Fig 4A）。c-Myc是Wnt／β-catenin信号的重要靶基因，在结肠癌中表达水平较高。

本研究表明，Tet对Wnt／β-catenin信号转导的抑制作用可能与下调IGFBP5表达有关；IGFBP5对于Wnt／β-catenin信号转导可能具有重要促进作用，但其具体调节机制还有待进一步深入研究。

［致谢：本实验在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成。感谢芝加哥大学何通川（Tongchuan He）教授慷慨为本研究提供实验所需的重组腺病毒载体。］

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Study on the relationship between Insulin-like growth factor binding protein 5 and anti-proliferating effect of tetrandrine on human colon cancer cells

WANG Dong-xu，YUAN Shuang-xue，WU Qiu-xiang，REN Chun-mei，CHEN Zhen-hua，GU Ge-yu，LI Shao-chun，SUN Wen-juan，WU Ke，HE Bai-cheng
（Chongqing Key Labrotory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing 400016，China，Dept of Pharmacology，Pharmacy School of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Abstract：Aim To investigate the anti-proliferatingeffect of tetrandrine（Tet）on colon cancer cells and its

possible molecular mechanism．Methods We intro-duced crystal violet staining and flow cytometry to ana-lyze the effect of Tet on proliferation in LoVo cells．Flow cytometry was used to detect the effect of Tet on apoptosis in LoVo cells．Western blot assay was taken to analyze the effect of Tet on the expression of insulin-like growth factor binding protein 5（IGFBP5）．Final-ly，luciferase reporter assay，recombinant adenovirus mediated over-expression or silence of IGFBP5 were used to analyze the possible role of IGFBP5 in the anti-proliferating effect of Tet on colon cancer cells．Re-sults Crystal violet staining and flow cytometery anal-ysis results showed that Tet could exert an anti-prolifer-ating effect and induce apoptosis in LoVo cells．Tet de- creased the expression of IGFBP5 in a concentration-dependent manner．Tet inhibited the transcriptional ac-tivity of pTOP-luc reporter，which could be reversed by exogenous expression of IGFBP5 mostly．Similar results were found in the expression of c-Myc，but IGFPB5 knockdown couldn’t reverse this effect．Conclusion Tet can inhibit the proliferation of colon cancer cells，and this effect may be mediated by down-regulating the expression of IGFBP5 to inhibit Wnt／β-catenin signa-ling transduction partly．

Key words：tetrandrine；colon cancer；anti-prolifera-tion；cell apoptosis；IGFBP5；Wnt／β-catenin signa-ling

作者简介：王东旭（1989－），女，硕士生，研究方向：分子药理学，E-mail：505484224＠qq．com；何百成（1972－），男，博士，教授，研究方向：分子药理学和干细胞生物学，通讯作者，E-mail：hebaicheng99＠ya-hoo．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81372120）

收稿日期：2015－06－23，修回日期：2015－07－29

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1403－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．016