葛根素对MPP＋诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程中p53和mir-34a表达的影响

赵素晨，程月发，吴庆文，闫春林，郝晓惠

（华北理工大学1．护理与康复学院；2．冀唐学院、3．医学中心实验室，河北唐山 063000）

葛根素对MPP＋诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程中p53和mir-34a表达的影响

赵素晨1，程月发2，吴庆文1，闫春林1，郝晓惠3

（华北理工大学1．护理与康复学院；2．冀唐学院、3．医学中心实验室，河北唐山 063000）

Effect of puerarin on expression of p53 and mir-34a in apoptosis of SH-SY5Y cell induced by MPP＋

ZHAO Su-chen1，CHENG Yue-fa2，WU Qing-wen1，YAN Chun-lin1，HAO Xiao-hui3

（1．College of Nursing and Rehabilitation of North China Univer-sity of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，Chi-na；2．Jitang College of North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063300，China；3．Medical Ex-periment Research Center of North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，China）

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．062．html

近年来，部分以p53为靶点的化合物研究推动着蛋白相互作用和蛋白突变体构象领域药物的新发现［1］，但有关中药单体分子对神经细胞退行性变过程中p53及其相关基因变化的研究尚不多见。本研究在前期相关实验基础上［2－4］，采用MPP＋诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型，进一步探讨葛根素是否通过调节p53及mir-34a表达来影响多巴胺神经细胞凋亡。

1　材料与方法

1．1细胞株 SH-SY5Y细胞株购自中国医学科学院细胞中心。

1．2主要药物与试剂 葛根素（中国食品药品检定研究院，纯度为96%）。MPP＋、Annexin-V／PI和Pifithrin-ɑ（Sigma）；DMEM／F12＝1∶1培养基、胰酶、胎牛血清（Gibco）；GADPH抗体（华安生物），p53抗体（Cell Signaling Technology）；SYBR Green qPCR和反转录试剂盒及引物（Invitrogen），引物序列见Tab 1。

Primer nameSequences u6RT primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′Forward primer 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′Reverse primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′mir-34aRT primer 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACT

GGATACGACACAACCA-3′

GSP 5′-GGGGGAATGGCAGTGTCT-3′R 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′β-actinForward primer CTTTGAGTTCGGTGGGGTCA Reverse primer GGGCCGTACAGTTCCACAAA p53Forward primer TTTTCCCCTCCCATGTGCTC

Reverse primer CAGTCTGGCTGCCAATCCA

GSP is the specific primer corresponding to miRNA，R is matched with the RT primer。

1．3仪器 CO2培养箱、凝胶成像系统及CFX96 Real-Time Systerm（Bio-Rad），倒置显微镜（Olympus），超净工作台（苏州净化设备厂），低温高速离心机（Hitachi），流式细胞仪（FACS Calibuar，BD）。

1．4细胞培养及分组 SH-SY5Y细胞接种于培养瓶中，DMEM／F12培养基（含10%的胎牛血清，青霉素1×105U· L－1，链霉素100 mg·L－1），置于37℃、5%CO2培养箱培养。实验分对照组，MPP＋模型组，葛根素低、中、高（50、100、150 μmol·L－1）＋MPP＋处理组以及Pifithrin-ɑ＋MPP＋处理组，共6组。

1．5流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞用低、中、高剂量的葛根素及40 mg·L－1的Pifithrin-ɑ预先作用3 h后，加入1 mmol·L－1的MPP＋继续培养24 h，消化，收集，PBS清洗，加入400 μL Annexin V-FITC结合液重悬，加5 μL Annexin V-FITC染料，室温避光孵育15 min，加10 μL的PI染色液，室温避光孵育5 min，上机检测。

1．6Western blot检测p53蛋白的表达 提取蛋白，测浓度，蛋白变性，SDS-PAGE电泳，转膜，抗体孵育，ECL显色，Image J软件对结果进行分析。

1．7RT-PCR检测p53及mir-34a基因的表达 提取RNA，测RNA浓度，按反转录试剂盒进行cDNA合成，用CFX96 Real-Time Systerm仪进行RT-PCR扩增，实验结果应用CFX软件分析。

1．8统计学分析 用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据均用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2　结果

2．1细胞形态学的改变 显微镜下观察，模型组细胞大部分细胞回缩，突起结构减少，细胞变圆，贴壁细胞减少；而葛根素预处理和给予Pifithrin-ɑ干预的细胞形态与模型组比较均有明显改善。

2．2流式细胞仪检测细胞凋亡 本次试验结果与前期的统计分析结果基本趋于一致［4］，葛根素可抑制MPP＋引起的细胞凋亡，与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；给予Pifithrin-ɑ阻断p53基因表达后，细胞凋亡率与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2．3Western blot检测p53蛋白表达 模型组与对照组比较，p53蛋白的表达量明显升高（P＜0.05），而给予葛根素干预后，p53蛋白的表达量又随葛根素浓度的增高逐渐降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。并且，给予Pifithrin-ɑ干预后，p53蛋白表达与模型组比较也明显降低（P＜0.05）。

2．4RT-PCR检测p53、mir-34a基因表达 本次检测p53基因表达结果与前期结果也基本相同，具有统计学分析的一致性［4］；加入p53抑制剂后，p53基因表达与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。模型组mir-34a基因表达量与对照组比明显升高（P＜0.05），给予葛根素干预后，随葛根素浓度的增加mir-34a基因表达量与模型组相比又明显降低（P＜0.05）；给予p53抑制剂阻断p53基因激活后的mir-34a基因表达量和模型组比较明显下降（P＜0.05），见Tab 2。

Tab 2 Expression of p53 and mir-34a gene in each group（±s，n＝6）

Tab 2 Expression of p53 and mir-34a gene in each group（±s，n＝6）

＃P＜0．05 vs control group；P＜0．05 vs model group．

Group　p53 gene　mir-34a gene Control　1．00±0．00　1．00±0．00 MPP＋model　1．79±0．08＃　2．02±0．16＃Pifithrin-ɑ　1．10±0．02　1．24±0．2450 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．66±0．03　1．64±0．14100 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．35±0．10　1．45±0．25150 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．19±0．04　1．31±0．20

3　讨论

3．1p53-mir-34a反馈调节环路与细胞凋亡 研究表明，miRNA-34家族作为p53的直接调控因子参与了细胞分化、凋亡和衰老等生物学进程，结合有关实验分析，mir-34a是受p53激活表达水平较高的miRNA。本研究结果，MPP＋使细胞中p53蛋白及p53mRNA的表达增高，且mir-34a基因表达也增高。而加入p53抑制剂干预后的细胞，mir-34a基因表达下降，可能是由于p53水平的降低影响了mir-34a的活性。目前研究发现，mir-34a能够通过E2F3和SIRT1上调p53，从而形成p53-mir-34a正向反馈调节环路［5－6］。后期我们将继续进行相关实验，进一步研究p53与mir-34a的反馈调节关系。

3．2葛根素保护PD的研究 近年来，研究发现葛根素可以抑制由H2O2氧化引起的细胞凋亡［7－8］。体、内外PD模型的相关研究表明，葛根素对p53表达具有一定调节作用［9］，本结果证明葛根素能降低MPP＋引起的细胞凋亡外，还从p53-mir-34a通路角度对葛根素抑制细胞凋亡的机制进行了一些初步新探索，结果显示，葛根素和p53抑制剂干预使得p53蛋白及p53和mir-34a基因的相对表达较MPP＋模型组降低，提示葛根素有可能通过抑制p53转录从而减少mir-34a基因表达。

（致谢：本实验在华北理工大学医学中心实验室完成。感谢老师们实验过程中的耐心指导，使得本研究顺利完成。）

参考文献：

［1］ 代晓丽，刘 静，罗 瑛，张继虹．靶向作用p53药物的研究进展［J］．中国药理学通报，2014，30（7）：912－6．

［1］ Dai X L，Liu J，Luo Y，Zhang J H．Research progress on drugs tar-geting p53［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30（7）：912－6．

［2］ Cheng Y F，Zhu G Q，Wang M，et al．Involvement of ubiquitin pro-teasome system in protective mechanisms of puerarin to MPP＋－e-licited apoptosis［J］．Neurosci Res，2009，63（1）：52－8．

［3］ 程月发，朱国旗，关亚丽，等．葛根素对MPP＋诱导的SH-SY5Y细胞线粒体途径凋亡的保护作用［J］．中国中药杂志，2011，36 （9）：1222－6．

［3］ Cheng Y F，Zhu G Q，Guan Y L，et al．The protective effect of pu-erarin to MPP＋－induced SH SY5Y cells on the apoptosis of mito-chondrial pathways［J］．China J Chin Mat Med，2011，36（9）：1222－6．

［4］ 闫春林，程月发，吴庆文，等．葛根素对MPP＋诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程中p53mRNA及相关基因表达的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2014，20（4）：154－8．

［4］ Yan C L，Cheng Y F，Wu Q W，et al．Role of p53 in neuroprotec-tive effects of puerarin against MPP＋-induced human neuroblasto-ma SH-SY5Y cell death［J］．Chin J Exp Tradit Med Formul，2014，20（4）：154－8．

［5］ Welch C，Chen Y，Stallings R L．MicroRNA-34a functions as a po-tential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells［J］．Oncogene，2007，26（34）：5017－22．

［6］ Yamakuchi M，Ferlito M，Lowenstein C J．mir-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105 （36）：13421－6．

［7］ Jiang B，Liu J H，Bao Y M，An L J．Hydrogen peroxide-induced ap-optosis in PC12 cells and the protective effect of puerarin［J］．Cell Bio Int，2003，27（12）：1025－31．

［8］ Bo J，Ming B Y，Gang L Z，et al．Protection by puerarin against MPP＋-induced neurotoxicity in PC12 cells mediated by inhibiting mitochondrial dysfunction and caspase-3-like activation［J］．Neu-rosci Res，2005，53（2）：183－8．

［9］ Li X Z，Zhang S N，Liu S N，Lu F．Recent advances in herbal med-icines treating Parkinson′s disease［J］．Fitoterapia，2013，84：273 －85．

中国图书分类号：R284.1；R329.25；R341；R745.7；R977.6

关键词：帕金森病；葛根素；p53；mir-34a；SH-SY5Y细胞；凋亡

Key words：Parkinson′s disease；puerarin；p53；mir-34a；SH-SY5Y cell；apoptosis

作者简介：赵素晨（1988－），女，硕士生，研究方向：神经康复学，Tel：0315-3725252，E-mail：zhaosuchen＠126．com；程月发（1967－），男，博士，副教授，研究方向：天然产物药理学，通讯作者，Tel：0315-8114108，E-mail：arthurcyf＠163．com

基金项目：河北省卫生厅重点医学研究项目（No 20110160）；河北省中医药管理局科研计划项目（No 2013180）；河北省自然科学基金资助项目（No H2014209300）

收稿日期：2015－06－20，修回日期：2015－08－23

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1479－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．031