组织自发荧光在大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤中的应用

田树红，王日超，邢桂兰，符 健

（海南医学院海南省药物安全性评价研究中心，海南海口 571199）

组织自发荧光在大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤中的应用

田树红，王日超，邢桂兰，符 健

（海南医学院海南省药物安全性评价研究中心，海南海口 571199）

中国图书分类号：R-332；R322.81；R445；R743.31

摘要：目的 基于特定的荧光检测技术，探讨组织自发荧光在大鼠局灶性脑缺血及再灌注损伤中的应用。方法 本研究通过caliper精诺真IVIS活体成像技术检测大鼠脑组织的自发荧光。通过荧光检测，比较正常大鼠和局灶性脑缺血／再灌注损伤大鼠脑组织对应部位自发荧光强弱的变化，并进行定量分析。结果 实验结果表明，局灶性脑缺血／再灌注损伤脑组织的自发荧光发生了明显变化，损伤部位的自发荧光信号明显增强，将荧光信号通过活体成像系统进行定量，与正常脑组织比较差异有统计学意义，P＜0.01。结论 大鼠脑组织在局灶性脑缺血／再灌注损伤后，脑组织的自发荧光明显增强，为大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤模型的研究及其评价提供新的方法。

关键词：大鼠；脑组织；自发荧光；局灶性脑缺血／再灌注；活体成像系统

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．058．html

大脑中动脉是人类脑卒中的多发部位［1］。脑卒中又称中风或脑血管意外，是由脑部血液循环障碍导致局部神经功能缺失的疾病，包括颅内和颅外动脉、静脉及静脉窦的疾病，其中以动脉疾病较为常见［2］。大脑中动脉阻塞模型是局灶性脑缺血的标准动物模型。然而在该模型的定量评价指标中主要以脑梗死面积及含水量测定为主［1，3］。在梗死面积的测定时，需要做脑切片，采用氯化三苯基四氮唑染色显示梗死的脑组织，其中粉红色为正常脑组织，白色为梗死区，然后拍照，运用相关软件计算每片脑组织的梗死面积，或者用“梗死范围”法，将白色脑组织挖下称重，以梗死组织质量占总脑质量的百分比作为脑梗死范围。很明显，传统的方法只能计算每片脑组织1个切面的梗死面积，“梗死范围”法误差更大，都无法精确的表现出脑梗死的真实情况。

组织自发荧光是一种常见的现象［1－3］，如果能用一种精密仪器，能检测到组织自发荧光并将其定量，那么就能解决传统方法不能解决的局灶性脑缺血／再灌注损伤模型梗死部位脑组织的精确定量评价问题。目前，应用荧光检测技术对正常大鼠和局灶性脑缺血／再灌注损伤大鼠脑组织进行自发荧光检测和荧光强度的定量分析还未见报道。Caliper Ki-netics IVIS活体成像系统能检测到较微弱的组织自发荧光，

而且能够对荧光强度进行定量分析。本研究运用该系统更加形象的展示出大鼠脑组织不同部位的自发荧光情况，更为精确的计算出脑梗死的面积，为大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤模型的研究及其评价提供新的依据。

1　材料与方法

1．1实验动物及饲养条件 SPF级SD大鼠购于广东省医学实验动物中心，体质量280～300 g，♂。实验动物饲养的环境条件符合国家标准（GB14925－2010）对SPF级实验动物环境条件的要求。实验室温度为20℃－26℃，最大日温差／℃≤4，相对湿度为40%－70%，最小换气次数≥15（次／h），空气洁净度为7级，相同区域的最小压差≥10 Pa，沉降菌最大平均浓度≤3（CFU／0.5 h·Φ 90 mm平皿），氨浓度≤14 mg／m3，噪声不高于60 dB，动物照度为15－20 lx。

1．2实验动物饲料及饮用水 实验动物饲料购于广东省医学实验动物中心，符合GB-14924.3-2010标准。饮用水经海口市疾病预防控制中心现场采样进行理化指标及微生物指标检测，所检测项目结果均符合现行国家《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）规定的限值要求。

1．3SD大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤模型的制备 采用线栓法（thread occlusion of the middle cerebral artery）制备SD大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤模型［1，4］：选择检疫合格的♂SD大鼠，体质量为280－300 g。经腹腔注射水合氯醛（300 mg·kg－1剂量）麻醉，取仰卧位固定，剪去手术部位毛发，安尔碘消毒皮肤，切开颈部皮肤，钝性分离，显露右侧颈总动脉（CCA）及迷走神经。结扎CCA、颈外动脉（ECA），动脉夹夹闭右侧颈内动脉（ICA）。在ECA结扎处用眼科剪剪一个小口，将准备好的线栓经该口插入，经ECA、ICA分叉处进入ICA，再向前推进18－20 mm时会有阻挡感，说明线栓已穿过MCA，到达大脑前动脉的起始部，堵塞MCA开口，造成脑组织局部缺血。2 h后缓慢拔出线栓实施再灌注损伤。

1．4局灶性脑缺血／再灌注模型神经症状和体征的评价局灶性脑缺血／再灌注模型神经症状和体征的评价参照Zea-longa［1，5］的5分测评方法进行评分。0分：无神经功能缺失，活动正常；1分：不能伸展对侧前爪；2分：爬行时出现外侧转圈（追尾征）；3分：行走时身体向对侧倒；4分：不能行走，意识丧失。24 h后麻醉放血处死动物，取出大脑，9 000 mg·L－1氯化钠注射液洗干净，置于干净的纱布上吸干表面的氯化钠注射液备用。

1．5SD大鼠脑组织自发荧光检测 采用caliper精诺真IVIS活体成像技术检测大鼠脑组织的自发荧光，选择荧光检测。依据Zealonga评分标准，选择分值为2分的动物进行脑组织自发荧光检测。将准备好的脑组织放入活体成像仪内合适的位置，然后进行拍照、数据分析和保存。先对脑组织进行完整分析，然后再横向切成数片进行局部分析，以确定损伤的部位和损伤的程度。

1．6SD大鼠正常脑组织和局灶性脑缺血／再灌注损伤脑组织自发荧光部位的比较 选择检疫合格的SD大鼠，挑选体重较为接近的动物进行比较。根据活体成像系统所得到的正常脑组织和局灶性脑缺血／再灌注损伤脑组织自发荧光所在的不同部位及其荧光强度差异分析，可以得出它们之间所存在的明显差异。

1．7组织自发荧光定量分析 采用caliper精诺真IVIS活体成像分析软件对实验结果进行定量分析。

2　结果

2．1SD大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤模型的制备 采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤模型，并依据Zea-longa的测评方法进行评分。结果表明，在12只造模动物中，有7只动物分值为2分（Fig 1A），表现体征为不能伸展对侧前爪，爬行时出现外侧转圈；有5只动物分值为3分，表现体征为不能伸展对侧前爪，行走时身体向对侧跌倒。Fig 1B为Fig 1A中所示动物的脑组织，从中可以看出，大脑右半球出现水肿，体积比左半球略大，且其颜色也比左半球的白。

Fig 1 Preparation of focal cerebral ischemia reperfusion injury model in rats

2．2灶性脑缺血／再灌注损伤脑组织自发荧光检测 采用小动物活体成像的荧光检测技术对局灶性脑缺血／再灌注损伤脑组织进行荧光检测（Fig 2），结果表明，局灶性脑缺血／再灌注损伤模型的左半球大脑和右半球大脑荧光呈现出明显的区别，右半球大脑荧光强度明显比左半球大脑强。从Fig 2 A－I可以看出，大脑组织损伤的部位和损伤的程度，荧光强度越强，损伤越严重。

2．3大鼠大脑组织TTC染色与自发荧光检测的比较 将正常大鼠和模型大鼠的大脑切片，先用小动物活体成像系统进行荧光检测，然后再进行TTC染色。实验结果如Fig 3所示。结果表明，局灶性脑缺血／再灌注损伤大脑梗死部位未被TTC染色，但其荧光强度明显增强。分别选取了7只正常和局灶性脑缺血／再灌注损伤SD大鼠的脑组织进行自发荧光检测和分析。其中损伤组动物的神经症状和体征的评分均为2分。将正常组和损伤组2个组的动物分别变为1－7号，相同号数同时检测，不同号数用不同的颜色表示。结果表明，正常动物同一脑组织左侧和右侧自发荧光强度无明显差异，基本一致。而损伤同一脑组织左侧和右侧自发荧光强度存在明显差异，如图中绿色箭头所示部分，其荧光强度明显高于其它部位。

Fig 2 Autofluorescence of focal cerebral ischemia reperfusion injury of brain tissue by IVIS

2．4组织自发荧光定量分析 从Fig 4中可以清晰的看出损伤脑组织的部位和范围。但是还需要将结果进行定量分析，即计算出整个脑组织的荧光强度。从Fig 4中还可以看出，脑组织的自发荧光强度和脑组织的损伤程度直接相关，损伤程度越重，自发荧光强度越强。因此，可以通过Caliper Kinetics IVIS活体成像系统对整个脑组织或者是感兴趣部位的自发荧光强度进行定量分析（Fig 5，Tab 1），所得到的数据再通过如SPSS等统计分析软件进行方差分析，比较正常脑组织和损伤脑组织的差异是否具有统计学意义。如Fig 5所示，可以随意定量分析自己所感兴趣的部位，或是将脑组织从这里切开再进行分析。如Tab 1所示，损伤组脑组织自发荧光强度与正常脑组织比较明显增强，且差异有统计学意义，P＜0.01。

Tab 1 Data analysis of brain tissue autofluorescence for normal control group and draw focal cerebral ischemia reperfusion group（±s，n＝7）

Tab 1 Data analysis of brain tissue autofluorescence for normal control group and draw focal cerebral ischemia reperfusion group（±s，n＝7）

P＜0.01 vs normal control group．

Group　Fluorescence intensity（p／sec／cm2／st μW／cm2）Normal　1．62E＋08±4．01E＋07 Damage model　5．73E＋08±4．57E＋07

Fig 3 TTC staining of rat brain tissue with spontaneous fluorescence detection

Fig 4 Autofluorescence of brain tissue for normal and draw focal cerebral ischemia reperfusion injury of SD rats brain tissue

Fig 5 Quantitative analysis of organization spontaneous fluorescence

3　讨论

局灶性脑缺血／再灌注模型的造模方法很多，比如线栓法、电凝法、光化学法和血栓法等［1］，技术也非常成熟。但对于脑梗死的评价方法还有待完善和创新。本研究首次提出用组织自发荧光来评价局灶性脑缺血／再灌注损伤的脑组织。

我们通过研究发现，通过活体成像系统能非常好地检测到脑组织自发荧光；其次，局灶性脑缺血／再灌注损伤部位的脑组织自发荧光强度与正常脑组织相比明显增强，且实验结果具有显著统计学意义；第三，不用将大脑组织切片，也不用经过TTC染色以及繁琐的梗死面积和体积的计算，可以直接通过活体成像系统软件精确而又快速地计算出梗死部位或任意部位或整个脑组织的自发荧光的强度进行定量分析。

从Fig 3D和Fig 5D图片中可以看出，将脑组织从荧光强度最强的部位横向切开成片再进行自发荧光检测，右侧大脑不同梗死部位荧光强度也有所不同。综合分析Fig 3C和D，结果表明：右侧大脑的尾状壳核、胼胝体和苍白球等部位荧光强度明显强于大脑皮质层。这说明即便是在均未被TTC染色的梗死区，不同部位自发荧光强度也具有较大差异。损伤程度较低的左侧大脑自发荧光强度也明显低于右侧大脑，而正常脑组织左右侧大脑的自发荧光强度并没有明显的区别。大鼠的脑组织在脑缺血／再灌注损伤时，损伤部位的受体活化效应可引发大量的Ca2＋内流，同时激活细胞内Ca2＋库的释放，并导致细胞内游离Ca2＋超载［6］。因此，我们推测损伤脑组织自发荧光明显增强可能与细胞内游离Ca2＋超载有关。在今后的研究中，我们将进一步具体分析梗死区域不同部位以及正常脑组织不同部位的自发荧光强度的差异及其产生这种差异的原因。

参考文献：

［1］ Zhou G X，Gao C，Xu P，et al．Replication methodology of animal models for human disease［M］．Shanghai：Shanghai scientific and technological literature press，2008：249－51．

［2］ Walberer M，Stolz E，Muller C，et al．Experimentalstroke：ischaemic lesion volume and oedema formation differ among rat strains（acom-parison between Wistar and Sprague-Dawley rat susing MRI）［J］．LabAnim，2006，40（1）：1－8．

［3］ Sakurama T，Kitamura R，Kaneko M．Tissue-type plasminogen acti-ator improves neurological functions in a rat model of thromboem-bolic stroke［J］．Stroke，1994，25（2）：451－6．

◇研究简报◇

［4］ Toshima Y，Sstoh S，Ikegaki I，Asano T．A new model of cerebral microthrombosis in rat and the neuropotective effect of a Rho-Ki-nase inhibitor［J］．Stroke，2000，31（9）：2245－50．

［5］ Lin C L，Calisaneller T，Ukita N，et al．A murine model of sub-arachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm［J］．Neurosci Meth，2003，1（123）：89－97．

［6］ Jensen A，Garnier Y，Middelanis J．Perinatal brain damage-patho-physiology to prevention［J］．Europ J Obstet Gynecol Reproduct Bi-ol，2003，110（suppl）：70－9．

Application of tissue spontaneous fluorescence in draw focal cerebral ischemia reperfusion injury of rats

TIAN Shu-hong，WANG Ri-chao，XING Gui-lan，FU Jian
（Hainan Research Center for Drug Safety Evaluation，Hainan Medical University，Haikou 571199，China）

Abstract：Aim To discuss the application of tissue spontane-ous fluorescence for draw focal cerebral ischemia reperfusion in-jury in rats based on specific fluorescence detection technology．Methods The change of spontaneous fluorescence WAS COM-PARED between the brains of normal rats and those of rats with draw focal cerebral ischemia-reperfusion injury and an quantita-tive analysis was then made．Result The results showed that spontaneous fluorescence of brain tissue for focal cerebral ische-mia reperfusion injury changed significantly．Spontaneous fluo-rescence signal of injury considerably enhanced．The fluores- cence signal which was quantified by IVIS had significant statisti-cal significance compared with normal brain tissue，P＜0．05．Conclusion Our research shows that spontaneous fluorescence of brain tissue enhances obviously after focal cerebral ischemia-reperfusion injury．Our research provides a method for the re-search and evaluation of focal cerebral ischemia-reperfusion inju-ry model in rats．

Key words：rat；brain tissue；autofluorescence；focal cerebral is-chemia reperfusion；in vivo imaging system

作者简介：田树红（1980－），男，硕士，助理研究员，研究方向：药理学与毒理学、抗肿瘤药效学，E-mail：18089862900＠163．com；符 健（1960－），男，博士，教授，研究方向：药理毒理学，通讯作者，Tel：0898-66982118，E-mail：Fujian．hnmc＠163．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81160408）

收稿日期：2015－06－12，修回日期：2015－07－27

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1473－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．029