DNA-SNP等位基因比率分析快速诊断产前唐氏综合征

张有成, 张志军, 潘国珍, 李　岚, 冯　燕

(贵州省人民医院 妇产科, 贵州 贵阳, 550002)

DNA-SNP等位基因比率分析快速诊断产前唐氏综合征

张有成, 张志军, 潘国珍, 李岚, 冯燕

(贵州省人民医院 妇产科, 贵州 贵阳, 550002)

摘要:目的探讨羊水胎儿上皮细胞DNA-单核苷酸多态性(SNP)等位基因比率分析法快速诊断产前唐氏综合征的效果。方法选取产前诊断为21三体单胎妊娠的冻存羊水标本24例及产前诊断为二倍体单胎妊娠的标本76例。利用基质辅助激光吸收离子化时间飞行质谱技术(MALDI-TOF)对位于21号染色体上的一个SNP位点，rs7844进行了杂合度的检测，对杂合子样本进行等位基因比率分析。结果100例羊水标本中，检出rs7844杂合子样本26例，其中21三体6例，二倍体20例。DNA-SNP等位基因比率分析诊断产前唐氏综合征只需1～2 d, 但诊断敏感性可达100%。结论羊水细胞DNA-SNP等位基因比率分析可达到快速诊断产前唐氏综合征的目的。

关键词:羊水细胞; 单核苷酸多态性; 产前诊断; 唐氏综合征

唐氏综合征是最常见的先天性智力低下性疾病[1], 因为缺乏有效的治疗方法，所以该病的出生前诊断及处理显得尤为重要。目前，用来控制唐氏综合征发病率的出生前检测方法主要有血清学筛查[2]、超声筛查[3]、非整倍体无创产前检测[4]、通过绒毛活检或羊膜腔穿刺获取胎儿细胞进行核型分析[5]或分子生物学检测[6]等。迄今为止，绒毛或羊水细胞核型分析仍然是产前诊断唐氏综合征的金标准[7]，其中应用最多的是中孕期羊水细胞核型分析。该检测方法虽然取材方便，结果可靠，但也有其不足的地方。一是从取材到得到检查结果，一般要花费3～4周的时间，使孕妇不得不度过一段非常焦虑、极其难熬的日子；还有一少部分孕妇因孕周过大，错过了体外羊水细胞培养的最佳取样时间，失去了检查的机会。因此有必要发现一种快速而又不需顾忌羊水细胞取样时间的产前诊断方法。本研究探讨一种无需进行羊水细胞体外培养就能对唐氏综合征进行快速产前诊断的分子生物学方法，现报告如下。

1资料与方法

1.1　羊水标本的采集与分类

羊水标本来源于2011年7月—2013年7月在本院实施产前诊断的孕妇，孕周16～27周，平均孕周21.5周，均为单胎妊娠。每例孕妇在进行羊膜腔穿刺时抽取羊水23 mL, 其中20 mL用来做细胞核型分析，另外3 mL标记可查询样本号后于-80 ℃冰箱冻存，作为实验用标本。实验时，选取已有明确细胞核型分析结果的冻存羊水标本100例，分成2组，其中实验组包括所有的21三体标本，共计24例；另外，随机选取76例二倍体样本作为对照组。

1.2　MALDI-TOF检测羊水标本rs7844杂合度

100份羊水标本于室温解冻后，采用基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取羊水细胞基因组DNA。在GenBank上选取21号染色体上一个杂合度较高的SNP，rs7844作为检测对象，应用MALDI-TOF检测该SNP的基因型分布情况。检测步骤包括聚合酶链反应(PCR)扩增样本DNA，单碱基延伸以及质谱检测延伸产物。PCR所用引物以及单碱基延伸所用寡核苷酸见表1。

表1　PCR所用引物以及单碱基延伸所用寡核苷酸

注：ACGTTGGATG为10 mol的附加链，以防止
质谱检测时误把剩余的引物当做单碱基延伸产物；
延伸产物中黑体字母为被延伸的SNP碱基。

1.2.1PCR扩增: 100份羊水细胞的DNA样本进行384孔反应表编制，注明每孔对应的DNA样本的编号。每孔反应体系5 μL, 包括10×Buffer 0.625 μL, MgCl2(25 mM)0.325 μL, 脱氧核苷酸(dNTP) 1 μL, 上下游引物各0.5 μL, TaqDNA聚合酶(QIAGEN公司) 0.1 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 0.95 μL。反应条件为: 94 ℃预变性15 min; 45个循环的94 ℃变性20 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min及72 ℃终末延伸3 min。产物4 ℃保存。

1.2.2单碱基延伸：PCR产物在延伸反应前，先进行碱基磷酸酶反应去除多余的dNTP。然后每孔中加入2 μL的延伸反应液，包括: 10×Buffer 0.2 μL, 反应终止液0.2 μL, 延伸引物0.804 μL，酶(SEQUENOM公司)0.041 μL, ddH2O 0.755 μL。反应条件为: 94 ℃预变性30 s; 40个循环的94 ℃变性5 s、52 ℃退火5 s、80 ℃延伸5 s; 每次变性反应后，退火及延伸进行5次循环后再进入下一次变性反应，以使底物充分反应。循环完成后72 ℃终末延伸3 min。产物4 ℃保存。

1.2.3检测：延伸产物在检测前，先用树脂纯化产物，以去除多余的盐离子。然后将反应产物转移到质谱检测芯片上，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3～5 s, 全自动分析，获得各个样本的等位基因型。

1.3　DNA-SNP等位基因比率分析

对质谱检测出的杂合子样本进行等位基因比率分析。杂合子样本的质谱检测峰中，用质量较小的等位基因的峰面积除以质量较大的等位基因的峰面积计算出等位基因比率。然后对21三体组和二倍体组的等位基因比率值进行比较分析。

2结果

2.1　100份羊水标本的rs7844基因型分布情况

MALDI-TOF检测结果可见, rs7844 SNP纯合子在质谱检测峰图中只有一个峰，而杂合子则呈双峰表现。通过质谱SNP分型检测，在所检测样本人群中，只发现两种rs7844等位基因型，分别是G/G及C/G。100例样本中检出rs7844杂合子样本26例，其中21三体6例，二倍体20例，杂合度为26%。

2.2　21三体组与二倍体组等位基因比率值比较分析结果

2组等位基因比率值比较分析结果可见，21三体组的等位基因比率值都背离于二倍体组的等位基因比率值。二倍体组的参考区间为1.244-0.710，以这个区间的最小值作为二倍体组的下限，则所有的21三体组样本的比率值都位于这个下限外，诊断敏感性达到了100%。

3讨论

本实验借助于时间飞行质谱技术的SNP分型及定量检测的性能[8-9]，通过对羊水细胞21号染色体上的一个单核苷酸多态性位点，rs7844的检测，进行了对唐氏综合征进行快速产前诊断的研究。通过质谱SNP分型检测，100例羊水标本中，只发现两种rs7844等位基因型，分别是G/G及C/G，杂合度是26%，而没有检测到C/C的等位基因型，说明本地区rs7844的基因型分布可能有其自己的特征。然后在杂合子样本可以满足分析的情况下，进行了利用等位基因比率分析对唐氏综合征进行产前诊断的研究。按照理论分析，一个二倍体杂合子胎儿，两个等位基因的比率应该是1C︰1G；而一个21三体杂合子胎儿，两个等位基因的比率应该是2C︰1G或1C︰2G。但是实际检测中，根据质谱峰图的直观表现以及两个等位基因的峰面积值，在21三体杂合子样本中，只检测出1C︰2G的等位基因型，而没有检测出2C︰1G的等位基因型。这也印证了在本地区G/G及C/G的基因型分布特征背景下，如果两种基因型组合产生21三体，那么应该以1C∶2G的基因型为多数。通过等位基因比率分析，建立起二倍体样本的参考区间，设定上限和下限，然后用每一个21三体样本的比率值去和这个参考区间进行比较，发现所有的21三体样本的比率值都位于这个参考区间最小值的下限外，从而使诊断的敏感性达到了100%。

检测结果说明利用DNA-SNP等位基因比率分析的方法产前检测唐氏综合征具有很高的准确性和灵敏度。而且该检测方法不需羊水细胞体外培养，因而取样时间不受孕周的限制；另外，从DNA提取到结果分析，在样本量可以满足分析的情况下，1～2个工作日即可完成。这恰恰补充了细胞核型分析的不足之处。

目前，用来快速产前检测唐氏综合征的方法有荧光定量聚合酶链反应(QF-PCR)[10]、多重连接探针扩增技术(MLPA)[11],以及基于高通量测序技术的非侵入性产前诊断[12]等。非侵入性产前诊断技术由于其检测的样本混有母血的成分，可靠性有待实践的考证[13]，作为一种筛查方案应该更为适宜。而QF-PCR受限于特定的检测人群。MLPA虽然可以覆盖到所有人群，但是由于其检测的是DNA样本扩增后的总量，所以检测结果可能会受到起始模板浓度的影响[14]。而本实验中，由于检测的是两个等位基因量的比率值，而并不是DNA扩增后的总量，所以即使样本的起始模板浓度参差不齐，也不会对实验结果造成影响，从而保证了检测结果的准确性。

由于本实验的目的是探讨利用DNA-SNP等位基因比率分析的方法产前诊断唐氏综合征的可行性，所以在实验中只选取了一个SNP位点进行实验研究，结果证明方案是可行的。当然，如果该检测方法能够应用到具体实践中，仅仅依靠一个SNP位点是不够的。在实验中，利用一个SNP(rs7844)位点，唐氏综合征样本的检出率达到了25%(6/24)。为了提高样本的检出率，就必须增加SNP杂合子的样本数，这可以通过增加SNP位点来得到实现。理论上分析，选取5个杂合度在26%以上的SNP位点就可以达到约100%的样本覆盖率[1-(1-26%)5≈100%]。而时间飞行质谱技术高通量检测的特性[15]，能够一次完成对多个SNP的分型检测[16]，可满足对这一检测的要求。当然，在实际检测中，应该先对本地区21号染色体上的SNP进行杂合度的筛查，可以筛选出杂合度高的SNP，选取的数目应该尽量达到100%的人群覆盖率，然后建立起每一个SNP的二倍体参考区间，这样才能够对待检样本进行唐氏综合征的产前诊断。

参考文献

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DNA-SNP allelic ratio analysis for rapid

diagnosis of prenatal Down syndrome

ZHANG Youcheng, ZHANG Zhijun, PAN Guozhen, LI Lan, FENG Yan

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ThePeople′sHospitalofGuizhouProvince,

Guiyang,Guizhou, 550002)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of amniocyte DNA-SNP allelic ratio on rapid diagnosis of prenatal Down syndrome. Methods A total of 100 frozen amniotic fluid samples of singleton pregnancy were selected, including 24 cases of trisomy 21 and 76 cases of euploid by prenatal diagnosis. The heterozygosity of rs7844, a single-nucleotide polymorphism (SNP) located in chromosome 21, was detected by using matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometer analysis, and the DNA-SNP allelic ratios of those cases with heterozygous SNPs were determined. Results26 cases with heterozygous SNP of rs7844 were found in 100 amniotic fluid samples, including 6 cases of trisomy 21 and 20 cases of euploid. The result of DNA-SNP allelic ratio for prenatal diagnosis of Down syndrome came out in 1 or 2 days, and its diagnostic sensitivity was 100%. ConclusionAmniocyte DNA-SNP allelic ratio analysis can be used for rapid prenatal diagnosis of Down syndrome.

KEYWORDS:amniocyte; single-nucleotide polymorphism; prenatal diagnosis; Down syndrome

基金项目:贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2013]2185号)

收稿日期:2014-12-06

中图分类号:R 714.5

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-084-03

DOI:10.7619/jcmp.201509024