不同剂量1,25二羟基维生素预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

许峰峰, 刘信龙, 徐正平, 杨　冰, 李　明, 张建忠,

肖丽鸿, 廖　环, 丁　强, 李政卫

(解放军第455医院, 上海, 200052)

不同剂量1,25二羟基维生素预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

许峰峰, 刘信龙, 徐正平, 杨冰, 李明, 张建忠,

肖丽鸿, 廖环, 丁强, 李政卫

(解放军第455医院, 上海, 200052)

摘要:目的探讨不同剂量1,25二羟基维生素预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法将60只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和VD30.5、1.0、1.5 μg/kg预处理组，比较各组神经行为评分、炎性因子及TRL2、4水平。结果与模型组相比，随着VD3剂量的增加，神经行为评分和脑梗死面积均明显减少, VD3-3组改善最为明显(P<0.05); 随着剂量的增高，各实验组IL-6和TNF-α水平降低越明显，具有明显的剂量变化趋势(P<0.05); IL-10、MDA各组变化差异无统计学意义(P>0.05); VD3各组TRL2和TRL4均明显低于模型组，且随着VD3剂量增加，TRL2和TRL4降低程度明显增加(P<0.05); 再灌注5 d后观察各组大鼠存活情况，以VD3-3组为最高83.33%, 差异具有统计学意义(P<0.05)。结论VD3对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用具有剂量依赖性，其机制可能与抑制TLR2、4信号转导通路，减少炎性因子产生有关。

关键词:1,25二羟基维生素D3; 局灶性脑缺血再灌注损伤; TLR2、4; 炎性因子

Protective effect of different dose of

随着临床治疗手段的提高，血管内介入、溶栓、手术等的开展，使部分缺血性脑血管病患者得到较好治疗，但这些手段对随后发生的局灶性脑缺血再灌注损伤并无直接帮助，患者预后仍较差[1]。目前局灶性脑缺血再灌注损伤机制并未完全清楚，有学者[2]认为与缺血再灌注过程中氧自由基释放、神经元细胞能量代谢障碍、细胞内钙离子超载、微循环功能障碍、细胞因子、线粒体功能异常、Kupffer细胞激活及中性粒细胞的活化等因素有关。目前，围术期脑缺血再灌注损伤的防治策略包括低温、改良外科技术、药物防治、缺血及药物预处理、基因治疗等方面。但迄今为止，上述众多的策略尚未妥善解决临床脑缺血再灌注所致的神经功能受损。

最近有学者[3-4]报道活性1,25二羟基维生素D3可通过抗氧化、提高HSP70的表达及对凋亡通路的影响保护肾缺血再灌注损伤，对脑缺血再灌注损伤也有保护作用，但具体机制未见报道。同时，外源性维生素D3在脑缺血再灌注损伤中治疗中的作用也无相关报道。本研究拟以大鼠可逆性大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓法制作的局灶性缺血再灌注模型为基础，通过评价不同剂量1,25二羟基维生素D3处理对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，现报告如下。

1资料与方法

1.1　试验动物

健康雄性SD大鼠60只，质量250～300 g, 由上海复旦大学实验动物中心提供，批号20130546。采用随机数字表分为假手术组(Sham组), I/R组和不同剂量VD3组共5组，每组12只。

1.2　建模及干预方法

I/R组采用Longa栓线方法：以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔麻醉，颈正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)，动脉夹临时阻断CCA、ICA，分离ECA远端，在ECA远端穿线结扎，在远端离断ECA，用眼科镊轻轻拉ECA残端使其与ICA呈一直线，松开ICA动脉夹，从ECA残端插入备好的4-0硅涂层聚丙烯单丝手术用缝合线，从分叉处起深度约18 mm, 遇到阻力判断为阻塞大脑中动脉，停止进线。在ECA残端穿线，结扎紧ECA残端，松开CCA动脉夹。将栓线尾端剪断留少许约5 mm, 缝合筋膜和皮肤。整个手术在具有反馈调节加热毯上进行，保持直肠温度(37±1) ℃,术后空调房保暖。栓线栓塞90 min后再灌注，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔麻醉，重新打开伤口，将栓线拔出，并重新结扎ECA残端，缝合筋膜和皮肤。Sham组仅暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，不予以颈内动脉栓线处理。术后大鼠分笼饲养。VD3组于再灌注前8 d每天腹腔注射0.5、1.0、1.5 μg/kg的1,25二羟基维生素D3。

1.3　观察指标和测定方法

1.3.1细胞表面TLR2、4测定：处死动物后固定取脑，分离中枢神经单个核细胞，以流式细胞仪进行表面TLR2、4测定。

1.3.2神经功能评分：偏侧肢体无力或瘫痪,是脑卒中的典型症状。本实验参照文献五分制评分标准，对缺血再灌注2、24 h各组小鼠进行神经功能评分: 0分：无神经功能缺损症状; 1分：左前肢不能完全伸直; 2分：向左侧旋转; 3分：行走时向左侧倾倒; 4分：不能自主行走或伴有意识水平降低; 5分：死亡。评分在取材前进行。

1.3.3脑梗死体积测定：小鼠断头处死，迅速取出脑组织，去除嗅球、小脑及低位脑干，-20 ℃冰冻10 min, 排刀自前极连续切取2 mm厚度脑冠状切片4片，置2% 2,3,5-氯化三苯基四氮吐(TTC)(上海精析化工)生理盐水溶液中37 ℃避光孵育30 min, 10%甲醛中性缓冲液(pH 7.4)固定过夜。微距相机拍摄，Image Proplus5.1图像分析软件计算并统计脑梗死体积。

1.3.4IL-6、IL-10、TNF-α和 MDA含量测定：再灌注脑组织应用冰生理盐水清洗，用超声波组织粉碎机和0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)制成1∶10脑组织匀浆液，并分试管放置在-80 ℃冰箱。根据Buege and Aust提供的方法测定反应脂质过氧化产物丙二醛水平，单位: nmol/mgProt; 双抗体ELISA法测定IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.4　统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，应用Prism 5软件进行统计分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)及两样本均数比较的t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1　各组大鼠神经行为评分和脑梗死体积分析

与假手术组相比，各组均建立脑缺血再灌注模型成功(P<0.05); 与模型组相比，随着VD3剂量的增加，神经行为评分和脑梗死面积均明显减少, VD3-3组改善最为明显(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠神经行为评分和脑梗死体积分析

与假手术组比较，*P<0.05; 与模型组比较，#P<0.05。

2.2　各组大鼠细胞因子比较

各组与假手术组IL-6和TNF-α差异具有统计学意义(P<0.05); 随着剂量的增高，各实验组IL-6和TNF-α水平降低越明显，具有明显的剂量变化趋势(P<0.05); IL-10、MDA各组变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3　各组大鼠TRL2、4比较

VD3各组TRL2和TRL4均明显低于模型组，且随着VD3剂量增加, TRL2和TRL4降低程度明显增加(P<0.05)。见表3。

表2　各组大鼠细胞因子水平比较

与假手术组比较，*P<0.05; 与模型组比较，#P<0.05。

表3　各组大鼠TRL2、4比较　%

与假手术组比较，*P<0.05; 与模型组比较，#P<0.05。

2.4　各组大鼠存活情况分析

再灌注5 d后观察各组大鼠存活情况，模型组存活率为41.46%(5/12), VD3-1组存活率为58.33%(7/12), VD3-2组存活率为66.67%(8/12), VD3-3组存活率为83.33%(10/12), 以VD3-3组为最高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

国内外尚无1,25二羟基维生素D3对局灶性脑缺血再灌注损伤保护的具体机制，特别是在抗氧化、TLR信号通路、NF-κB凋亡信号通路中机制研究方面，缺乏相关文献报道。但已有研究[5]发现，活性维生素D3可通过抗氧化、提高HSP70的表达及对凋亡通路的影响保护肾缺血再灌注损伤，1,25(OH)2D3可通过负反馈调节衰减巨噬细胞中TLR信号通路导致的炎症反应，抑制核因子kB(NF-kB)的激活。作者利用1,25二羟基维生素D3对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型进行预处理，探索其是否具有保护作用及作用机制。

结果发现，高剂量组(1.5 μg/kg)神经行为评分和脑梗死面积均明显减少，说明1,25二羟基维生素D3对I/R大鼠神经行为具有明显保护作用，而且其作用效果有随浓度增加的趋势。从存活情况来看，高剂量组存活率也原因高于其他各组。同时，在这些指标中，较低剂量的2组(0.5 μg/kg、1.0 μg/kg)差异并不明显，作者猜测1,25二羟基维生素D3对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用有阈剂量的存在，只有当药物剂量或浓度到达某一水平时，其保护作用才会明显体现。但由于1,25二羟基维生素D3对I/R的保护作用研究目前尚少，此种猜想尚需进一步研究验证。

对其TRL2、4和炎性细胞因子的研究则显示, 1,25二羟基维生素D3能够降低TRL2、4和IL-10、TNF-α水平。Marsh BJ[6]认为, TLRs可能是炎性细胞因子的上游触发位点。当I/R状态下, TLR可以与相应受体如PAMPs结合，在CD14协助下TLR自身激活并激活NF-kB等核转录子，从而引起下游IL-6、IL-10、IL-1、TNF-α等炎性因子和介质的合成，进而进一步影响机体的免疫反应强度，使缺血后炎性损伤减轻。Hyakkoku K等[7]利用敲除TLR4小鼠进行的脑缺血动物模型中发现，去除TLR4后模型脑梗死面积明显减少，炎症反正程度也减轻。这也证实TLR信号传导系统在脑缺血再灌注损伤的发生中具有重要作用，对其采取措施，减少或阻断该过程的发生有利于缺血再灌注损伤的预防和治疗。1,25二羟基维生素D3高剂量状态下此作用显著，说明抑制TLR信号转导过程，抑制下游炎性因子表达是1,25二羟基维生素D3作用的重要通路。Wang Y等[8]利用VD3对大鼠中脑的再灌注损伤研究中也支持类似结论。

也有学者[9-10]认为局灶性脑缺血再灌注损伤中存在抗氧化机制的紊乱，氧自由基对大脑富含脂肪链的生物膜进行攻击，导致出现“瀑布状”脂质过氧化反应，从而引起脑细胞生物膜的破坏，干预机体的抗氧化过程可以发挥治疗作用。但作者在VD3的作用机制中并未发现MDA的变化，可能脑I/R的发生机制更为复杂，VD3更主要是作用于TLRs信号转导通路，对机体氧化/抗氧化系统也可能由其他指标完成。不过由于此类研究目前尚无国内外证据支持，仍需进一步探讨和验证。

参考文献

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[2]韩巨, 孙燕, 张涛, 等. 缺血耐受大鼠局灶性脑梗死后续血管再生作用的实验研究[J]. 山东大学学报: 医学版, 2011, 49(3): 8.

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[4]Losem-Heinrichs E, Gorg B, Redecker C, et al. 1Alpha, 25-dihydroxy-vitamin D3in combination with 17 beta-estradiol lowers the cortical expression of heat shock protein-27 following experimentally induced focal cortical ischemia in rats[J]. Arch Biochem Biophys, 2012, 439(1): 70.

[5]Ezqur M E, Vzldez S R, Seltzer A M. Inflammatory responses of the substantia nigra after acute hypoxia in neonatal rats [J].Experimental Neurol, 2011, 197(2): 391.

[6]Marsh B J, Williams-Karnesky R L, Stenzel-Poore M P. Toll-like receptorsignaling in endogenous neuroprotection and stroke[J]. Neuroscience, 2010, 158(32): 1007.

[7]Hyakkoku K, Hamanaka J, Tsuruma K, et al. Toll-like receptor 4( TLR4), but not TLR3 or TLR9, knockout mice have neuroprotective effects against focal cerebral ischemia[J]. Neurosience, 2010, 171(3): 258.

[8]Wang Y, Chiang Y H, Su T P, et al. Vitamin D3attenuates cortical infarction induced by middle cerebral arterial ligation in rats[J]. Neuropharmacology, 2010, 39(21): 873.

[9]Kim E J, Park Y G, Baik E J, et al. Dehydroascorbic acid prevents oxidative cell death through a glutathione pathway in primary astrocytes[J]. J Neurosci Res, 2011, 79(5): 670.

1,25-dihydroxyvitamin preconditioningon

focal cerebral ischemia reperfusion injury

XU Fengfeng, LIU Xinlong, XU Zhengping, YANG Bing, LI Ming,

ZHANG Jianzhong, XIAO Lihong, LIAO Huan, DING Qiang, LI Zhengwei

(Shanghai455thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Shanghai, 200052)

ABSTRACT:Objective To investigate the protective effect and mechanism of different doses of 1,25-Dihydroxyvitamin preconditioning on focal cerebral ischemia reperfusion injury. MethodsA total of 60 male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and VD3pretreatment group with different dose of 0.5, 1.0 and 1.5 μg/kg. Neurobehavioral score, inflammatory factors and the level of TRL2,4 were compared among five groups. ResultsCompared with the model group, with the doses of VD3increased, neurobehavioral score and area of cerebral infarction significantly decreased, VD3-3 group improved significantly (P<0.05). With the dose increased, levels of IL-6 and TNF-α decreased significantly, and the change showed obvious trend with dose (P<0.05). There were no significant differences of IL-10 and MDA among five groups (P>0.05). TRL2 and TRL4 in each VD3group were significantly lower than those in the model group, and with the dose of VD3increased, TRL2 and TRL4 decreased significantly (P<0.05). The survival conditions of rats in VD3groups after 5 days of reperfusion were observed, 83.33% in VD3-3 group was the highest, and there were significant differences (P<0.05). ConclusionThe protective effect of VD3on focal cerebral ischemia reperfusion injury is dose dependent, and its mechanism may be related to inhibition of signal transduction pathway of TLR2, 4 and reduction of inflammatory factor production.

KEYWORDS:1,25-dihydroxyvitamin D3; focal cerebral ischemia reperfusion injury; TLR2, 4; inflammatory factor

基金项目:全军医药卫生科研基金课题

收稿日期:2014-11-16

中图分类号:R 743

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-028-04

DOI:10.7619/jcmp.201509008