农杆菌介导的ACO-RNAi载体对百合胚性愈伤的转化

田菲菲，刘雅莉, 杜灵娟，权永辉

(1 旱区作物逆境生物学国家重点实验室(西北农林科技大学)/农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西 杨凌 712100；2 西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

农杆菌介导的ACO-RNAi载体对百合胚性愈伤的转化

田菲菲1,2，刘雅莉1,2, 杜灵娟1,2，权永辉1,2

(1 旱区作物逆境生物学国家重点实验室(西北农林科技大学)/农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西 杨凌 712100；2 西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 建立高效稳定的百合遗传转化体系，以得到甁插寿命长、开花早的百合转基因品种。【方法】 以OT百合“罗宾那”的胚性愈伤组织为供试材料，从共培养方式(固体或液体共培养)、农杆菌菌液浓度(OD600=0.4，0.6，0.8，1.0，1.2)、亚精胺浓度(0.5，1.0，1.5，2.0 μmol/L)以及超声波处理(功率60 W，处理时间分别为0，1，2，3，4 min)等方面对百合遗传转化体系进行优化。【结果】 液体共培养能提高稳定表达率并减少褐化率，稳定表达率为 13.00%，褐化率为55.00%；农杆菌菌液浓度(OD600)在0.8时为最适侵染浓度，此时稳定表达率为12.77%，褐化率为55.00%；侵染前向菌液中加入2.0 μmol/L亚精胺能提高转化效率，稳定表达率为88.30%；当超声波功率为60 W、处理时间为3 min时，百合胚性愈伤的瞬时表达率和稳定表达率均最高，分别为88.90%和27.33%；潮霉素抗性植株经GUS组织化学染色、目标基因PCR检测及Southern blot分析，证明目的基因已整合到百合基因组中。【结论】 转化条件的优化能够有效提高农杆菌介导的百合胚性愈伤组织的遗传转化率。

百合；转基因；农杆菌；超声波；亚精胺

百合(Liliumspp.)为单子叶植物亚纲百合科(Lilicaccae)百合属(Lilium)多年生草本球根花卉[1]，其花朵硕大，色彩丰富，花姿清雅，观赏价值高[2],被广泛用于切花和盆栽生产[3]。百合花期长短及瓶插寿命是衡量其观赏价值的一个重要指标，因此加强百合分子育种，创造新的百合品种，可以带来更高的经济效益和社会效益。目前很多研究表明，百合为乙烯跃变型花卉，乙烯的合成和释放会缩短百合花切花寿命[4]，而ACC氧化酶(ACO)是乙烯合成的关键限速酶。因此，通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术控制百合花期乙烯的生物合成，能有效延长花期和瓶插寿命，提高观赏价值，该研究具有广阔的应用前景[5]。

农杆菌介导的遗传转化是目前转基因最常用的方法。百合为单子叶植物，并非农杆菌的天然寄主[6]，虽可以实现侵染转化[7-8]，但遗传转化效率低，这成为制约百合转基因育种发展的主要因素。影响农杆菌介导的遗传转化效率的因素很多，如菌种的选择、菌液活性、侵染时间、共培养方式、pH值[9]及外植体的类型和状态等。并且农杆菌介导的遗传转化是农杆菌和外植体共同作用的复杂过程。植物组织处于代谢活跃的状态，分裂状态的细胞更易整合外源DNA，从而能提高外源基因的瞬时表达和转化效率[10]。根癌农杆菌附着在植物细胞壁上并相互作用，是转化的先决条件。超声波处理能在外植体的表面产生微伤口，使外源基因进入，从而能够提高转化效率。Trick等[11]首次将超声波技术用于农杆菌介导的植物遗传转化中，建立了超声波辅助农杆菌转化技术(SATT)。SATT在很多植物中已成功得到应用，如大豆、麻类等，转化效率明显提高[12-13]。

本研究以百合胚性愈伤组织作为受体材料进行转化，探讨了共培养方式、菌液浓度、亚精胺及超声波处理对转化效率的影响，以期为得到高效稳定的百合遗传转化体系及开花早、甁插寿命长的百合转基因品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 试验于2012-07-2013-09在农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室进行。供试材料为OT百合“罗宾娜”(LiliumOriental×Tumpet ‘Robina’)胚性愈伤组织，保存在胚性愈伤组织保持培养基上(MS+1 mg/L 毒莠定+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝胶)。

1.1.2 菌株与载体 试验用菌株为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，由农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室保存。转化所用的载体pCAMBIA1301-pAR-CAM-RNAi-ACO由该实验室构建，此载体的构成如图1所示。

质粒T-DNA区段上携带有β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，由CaMV 35S启动子调控；CaMV 35S启动子调控的潮霉素磷酸转移酶基因(Hyg)作为选择标记基因；目的基因为CaMV 35S启动的发卡结构，包含正义和反义的插入片段。

1.2 方 法

1.2.1 农杆菌菌液的制备 取含植物表达载体的农杆菌菌液60 μL，加入到含有50 mg/L卡纳和25 mg/L利福平的20 mL液体YEB培养基中,28 ℃、180 r/min摇床上振荡培养12～16 h。4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃上清液收集菌体沉淀，然后向菌体中加入25 mL重悬液(MS+30 g/L 蔗糖+10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸+100 μmol/L 乙酰丁香酮)，28 ℃、180 r/min振荡培养2～3 h后加入重悬液调节菌液OD600为0.4，0.6，0.8，1.0和1.2备用。

1.2.2 转化及侵染 在超净工作台上将胚性愈伤组织浸入制备好的农杆菌菌液中，浸泡10 min，期间不断轻轻振荡使菌液与外植体充分接触，然后将外植体转移至无菌滤纸上，吸干多余菌液后移入共培养基(MS+30 g/L蔗糖+10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸+100 μmol/L乙酰丁香酮+3 g/L植物凝胶)中，(25±2) ℃黑暗条件下共培养3 d，之后将外植体转移至含有500 mg/L头孢霉素的灭菌水中浸泡10 min，无菌水冲洗3～5次，滤纸吸干多余液体后移入筛选培养基中，筛选培养基为MS+1.0 mg/L 毒莠定+500 mg/L头孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L 蔗糖+3 g/L植物凝胶，于(25±2) ℃、16 h/d 光照条件下培养，每15 d继代1次。

1.3 转化体系的优化

1.3.1 共培养方式对转化效率的影响 按1.2.2中的转化方法，将侵染过的外植体置于固体或液体共培养基中，固体共培养的培养基为MS+30 g/L蔗糖+10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸+100 μmol/L 乙酰丁香酮+3 g/L植物凝胶；液体共培养培养基为 MS+30 g/L蔗糖+10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸+100 μmol/L 乙酰丁香酮。液体共培养时，在无菌培养皿中铺2层无菌滤纸，吸取5 mL液体共培养基将滤纸浸润。(25±2) ℃黑暗条件下共培养3 d。

1.3.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 向农杆菌菌液中加入重悬液，使农杆菌菌液浓度(以OD600表示)分别为0.4，0.6，0.8，1.0，1.2。将制备好的不同浓度的农杆菌菌液振荡侵染百合胚性愈伤10 min，然后转移至液体共培养基上，(25±2) ℃黑暗条件下共培养3 d。

1.3.3 亚精胺对转化效率的影响 农杆菌与外植体侵染前，向农杆菌菌液中分别加入0.5，1.0，1.5，2.0 μmol/L亚精胺，以不加亚精胺为对照，对外植体进行侵染。

1.3.4 超声波处理对转化效率的影响 将外植体浸入到装有50 mL农杆菌菌液的三角瓶中，无菌封口膜封紧瓶口。将盛有外植体的三角瓶置于超声波破碎仪中进行超声波处理，超声波功率为60 W，处理时间分别为0，1，2，3，4 min。将超声波处理后的外植体继续在农杆菌菌液中浸泡，直到每个处理外植体与菌液共同作用时间为10 min，将侵染后外植体置于无菌滤纸上吸干多余菌液，之后接种于液体共培养基中培养。

以上每个处理均取外植体40～60个，每处理重复3次。每个处理共培养3 d后脱菌处理，随机取部分外植体进行GUS组织化学染色，统计瞬时表达率，统计筛选培养4个月后得到的潮霉素抗性苗数，计算稳定表达率。

1.3.5 胚性愈伤组织筛选培养及植株再生 将脱菌处理的外植体置于筛选培养基(MS+1.0 mg/L 毒莠定 +500 mg/L头孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝胶)上，(25±2) ℃、16 h/d光照条件下培养，每15 d继代1次。2个月后将未褐化的胚性愈伤转移至再生培养基(MS+500 g/L头孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝胶)中，于(25±2) ℃、16 h/d的光照条件下培养，每2周继代1次，2个月后得到抗性再生植株。以不加入抗生素培养基得到的非转基因再生植株为空白对照。

1.4 转化植株的检测

1.4.1GUS组织化学染色分析 随机抽取10～20个以上各处理得到的外植体、筛选得到的抗性苗及空白对照组得到的未转化再生植株的叶片、根等组织浸入到GUS染液中，37 ℃过夜培养。然后用体积分数为10%，30%，50%，70%，90%的乙醇进行梯度脱色，观察并统计染色结果。

1.4.2 转基因植株的PCR检测 用CTAB法[14]提取抗性植株及未转化植株基因组DNA。对Hyg、GUS和ACO-PDK基因进行PCR扩增分析。其正反向扩增引物为：Hyg-F：5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′，Hyg-R：5′-CGCAAGGAATCGGTCAATACAC-3′，扩增片段为554 bp；GUS-F：5′-GCGTGGTGATGTGGAGTATTG-3′，GUS-R：5′-TCGGTGATGATAATCGGCTGAT-3′，扩增片段为301 bp；ACO-PDK-F：5′-GCTGACCTTCGGTACCAAGGTT-3′；ACO-PDK-R:5′-GCTAATATAACAAAGCGCAAGATCTATCAA-3′，扩增片段为364 bp。将质粒pCAMBIA1301和非转基因植株DNA分别作为阳性和阴性对照。反应体系为25 μL：2×TaqMasterMix 12.5 μL，Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，DNA 1 μL，RNase-Free Water 9.5 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸2 min。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统下观察并拍照。

1.4.3 转基因植株的Southern bolt检测 对GUS、Hyg和ACO-PDKPCR检测的阳性植株进行Southern blot检测，以质粒pCAMBIA1301-35S-RNAi-ACO为模板，用引物Hyg-F和Hyg-R的PCR扩增回收产物制备探针(554 bp)。具体操作方法参照DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒说明书。进行Southern blot检测时，取60 ng基因组DNA，用HindⅢ酶切过夜，酶切体系为500 μL：HindⅢ 40 μL；10×M buffer 50 μL；DNA 60 ng；加ddH2O至500 μL。酶切后用8 g/L琼脂糖凝胶电泳，经变性、中和后用高盐转移法将胶上的样品转移到尼龙膜上，进行杂交、洗膜、显影。

2 结果与分析

2.1 百合胚性愈伤组织转化体系的优化

2.1.1 共培养方式对转化效率的影响 共培养是菌液与外植体作用的关键步骤，液体共培养能增加共培养的湿度，不同的共培养方式对侵染效果有一定的影响。如表1所示，液体共培养能够显著提高百合胚性愈伤组织的瞬时表达率(53.30%)，并且筛选培养2个月后，褐化率较低，为55.00%，稳定表达率为13.00%；而固体共培养方式下，瞬时表达率为35.00%，褐化率较高为 76.70%，稳定表达率仅为6.70%，可见液体共培养能提高百合转化效率。这与2012年Wang等[15]报道的液体共培养能提高百合转化率的研究结果一致。

2.1.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 在农杆菌介导的遗传转化过程中，菌液浓度是影响转化效率的一个重要因素，菌液浓度过低对外植体的侵染不够充分，浓度过高则对外植体有毒害作用，因此农杆菌菌液浓度过低或过高对转化效率都有不良影响。表2显示，当农杆菌菌液浓度(OD600)为0.4时，百合胚性愈伤组织瞬时表达率和稳定表达率均较低，分别为8.87%和0.57%，并且褐化率也较高，为97.20%；之后随着菌液浓度(OD600)的升高，瞬时表达率和稳定表达率随之升高，褐化率逐渐降低，当菌液浓度(OD600)为0.8时，瞬时表达率和稳定表达率均达到最高，分别为61.63%和12.77%，并且后期筛选过程中褐化率较低，为55.00%；随着菌液浓度的继续升高，瞬时表达率和稳定表达率开始降低，褐化率升高，当菌液浓度(OD600)升至1.2时，对外植体的毒害作用比较重，褐化率明显提高，达到94.43%，并且稳定表达率也较低，仅为1.13%。因此，确定最适农杆菌菌液浓度(OD600)为0.8，这与张建鑫等[16]对百合的研究结果相吻合。

注：表中数据代表3次重复试验的“平均值±标准误”；同列数据后标不同小写字母者表示在P≤0.05水平差异显著。表3同。

Note:Data in the table are “average±standard error” of three repeat tests.Data in the same column with different lowercase letters have significant differences atP≤0.05 level.The same for Table 3.

2.1.3 亚精胺对转化效率的影响 如图2所示，向农杆菌菌液中加入亚精胺能提高百合胚性愈伤组织的瞬时表达率，随着亚精胺浓度的增加，瞬时表达率随之升高，当亚精胺浓度为2.0 μmol/L时，瞬时表达率达到最高，为88.30%，而未加入亚精胺的对照瞬时表达率仅为53.30%；当亚精胺浓度达到2.5 μmol/L时，瞬时表达率则明显下降。据此可确定亚精胺的最佳浓度为2.0 μmol/L。

2.1.4 超声波处理对转化效率的影响 超声波处理后对共培养3 d的外植体脱菌后进行GUS染色，统计瞬时表达率和稳定表达率，结果(表3)显示，随着超声波处理时间的延长，瞬时表达率和稳定表达率均随之升高，在超声波处理3 min后瞬时表达率及稳定表达率均最高，分别为88.90%和27.33%，明显比未经超声波处理的瞬时表达率及稳定表达率高；而超声波处理4 min后，瞬时表达率和稳定表达

率均下降，这可能与超声波处理时间过长造成的植物伤害不能恢复有关。

2.2 百合转基因植株的检测

2.2.1GUS组织化学染色 将筛选2个月后得到的抗性愈伤组织转移至再生培养基(MS+500 mg/L头孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝胶)中，每2周继代1次，2个月后得到再生植株。对未转化的胚性愈伤组织及再生植株的根、叶和筛选得到的抗性苗的根、叶等进行GUS组织化学染色，结果(图3)显示，转化后筛选2个月的胚性愈伤组织及筛选得到的抗性苗的根和叶经乙醇脱色后显示蓝色，而未转化的胚性愈伤组织及再生植株的根、叶经乙醇脱色后未显示蓝色。表明GUS基因在抗性愈伤组织及抗性苗的各个部位稳定表达。

2.2.2 转基因植株的PCR检测 本试验共得到344株转基因苗，随机抽取部分生长健壮的潮霉素抗性苗进行PCR分析。分别对GUS、Hyg和ACO-PDK基因进行扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果从42株转基因苗中扩增得到了分别为GUS基因(301 bp)、Hyg基因(554 bp)和ACO-PDK基因(364 bp)的目的条带。证明外源基因已整合到植物基因组中(图4)。

2.2.3 转基因植株的 Southern blot检测 为进一步验证目的基因是否整合到百合基因组中，对PCR检测为阳性的42个株系进行Southern blot检测，结果(图5)表明，有4株有杂交条带，其中植株1、2、4、5有杂交条带，且植株5有2条杂交带，说明其为Hyg的2个拷贝；植株1、2、4为单一杂交带，说明其为Hyg单拷贝，而未转化植株和植株3未产生杂交信号，表明目的基因Hyg未转化到植株的基因组中。

3 讨 论

农杆菌介导法是农杆菌和外植体共同作用的复杂过程。外植体的类型和状态对转化效率起着至关重要的作用。有研究表明，当植物组织处于代谢活跃的状态时，分裂状态的细胞更易整合外源DNA，从而提高外源基因的瞬时表达和转化效率[10]。本试验选用百合胚性愈伤组织作为转化受体材料，其具有繁殖速度快、细胞繁殖量大、转化效率高、嵌合体少、无性变异小的优点，是实际转基因工作中易转化成功的受体材料[17]。在实际的转基因过程中，胚性愈伤组织作为受体使遗传转化更易成功[18]，如De Benedetti等[19]利用百合花梗和花托诱导的胚性愈伤成功转入了RolA、RolB、RolC基因，使百合表型得以改变。

RNAi是通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因，通过人为引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(正义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的[20]。徐强等[5]构建了玉簪ACO hpRNAi载体，期望对玉簪进行转化后，使ACO基因转录后沉默从而达到抑制乙烯生物合成的目的。金晓玲等[21]运用RNAi技术，对郁金香进行遗传转化，希望通过沉默内源ACO基因以达到延长花期的目的。张建鑫等[16]将ACO反义基因导入东方百合“索邦”基因组中，期望控制百合花期乙烯的生成，并获得转基因苗。

目前，人们普遍认为在转化过程中对植物组织进行造伤处理能够提高转化效率。超声波处理可使植物组织在超声波机械能的作用下产生空化作用，使植物组织表面形成小气泡，小气泡破裂会对植物细胞造成微小创伤[22]，从而使细菌细胞侵入植物组织细胞中，以达到提高转化效率的目的。目前该方法已在玉米[23]等植物的遗传转化中得到应用。而超声波功率高低、处理时间长短都是影响转化效率的关键因素。超声波功率过高、处理时间过长时，对外植体的创伤大，使外植体不能恢复继而在后续的筛选中褐化死亡；超声波功率过低、处理时间短，则对外植体的造伤不够，外源基因不能顺利进入外植体，这也是在筛选过程中外植体褐化死亡的主要原因。因此，选择适宜的超声波功率及其处理时间很有必要。

多胺是植物细胞内维持pH的酯族阳离子，它参与植物细胞分裂、体细胞胚发生、根的形成、花芽分化、果实发育、次生代谢、衰老、生物和非生物胁迫应答反应、核糖体生物合成和细胞程序性死亡等过程[24-26]。同时，多胺还能影响根癌农杆菌vir区基因的感应[27]，能激活农杆菌vir区的毒性，增加T-DNA转移到植物组织中的概率。如Chong-Pérez等[28]报道，亚精胺能增强GUS在香蕉中的瞬时表达率。本试验就亚精胺对农杆菌介导的百合胚性愈伤组织的瞬时转化效率进行了初步探索，显示当亚精胺浓度为2.0 μmol/L时，其能显著提高GUS瞬时表达率。

4 结 论

本试验以百合胚性愈伤组织为外植体，进行超声波处理，并对转化过程中的一些条件进行了优化，结果表明，液体共培养能提高百合转化效率，农杆菌菌液浓度(OD600)为0.8时为其最适侵染浓度。本试验也就亚精胺对百合胚性愈伤组织瞬时表达率的影响进行了初步探讨，结果表明，侵染前向农杆菌菌液中添加2.0 μmol/L亚精胺，能提高瞬时表达率。当超声波功率为60 W、处理时间3 min、采取液体共培养方式时，均能提高百合胚性愈伤组织瞬时表达率和稳定表达率。GUS组织化学分析、PCR分析和Southern blot检测结果表明，目的基因Hyg已整合到百合基因组中。本研究结果为百合的分子育种及百合优良品种的选育奠定了基础。

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Genetic transformation of lily embryogenic callus with ACO-RNAi vector byAgrobacteriumtumefaciens

TIAN Fei-fei1,2,LIU Ya-li1,2,DU Ling-juan1,2,QUAN Yong-hui1,2

(1StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyinAridAreas(NorthwestA&FUniversity)/KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyandGermplasmInnovationinNorthwestChina,MinistryofAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China; 2CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to establish an efficient and stable genetic transformation system of lily to obtain genetically modified lily varieties with long service life and early flowering.【Method】 Using embryogenic callus of OT lily “Robina” as material,the lily genetic transformation system was optimized based on co-culture methods (liquid or solid co-culture),bacterial concentrations (OD600=0.4,0.6,0.8,1.0,and 1.2),and spermidine concentrations(0.5,1.0,1.5,and 2.0 μmol/L),and different sonication treatments (60 W power by 0,1,2,3,and 4 min respectively ).【Result】 Liquid co-culture improved the transformation efficiency (13.00%) and reduce browning rate (55.00%).Bacterial concentration of OD600at 0.8 was the optimum concentration with transient expression rate and browning rate of 12.77% and 55.00%,respectively.Adding 2.0 μmol/L spermidine to bacteria before infection improved the transformation efficiency with stable transformation rate of 88.30%.When the sonication power was 60 W and the processing time was 3 min,the highest lily embryonic callus transient expression rate and stable expression rate of 88.90% and 27.33% were obtained,respectively.AfterGUShistochemical analysis,PCR detection and Southern blot analysis,it was confirmed that the target gene was successfully integrated into the lily genome of hygromycin resistant plants.【Conclusion】 Optimizing the transformation conditions can effectively improve theAgrobacterium-mediated genetic transformation rate.

lily;transgene;Agrobacteriumtumefaciens;sonication;spermidine

2013-10-28

国家自然科学基金项目(31170652)

田菲菲(1987-)，女，陕西渭南人，在读硕士，主要从事园林植物分子育种研究， E-mail:tianfei918@163.com

刘雅莉(1960-)，女，陕西西安人， 教授，硕士,硕士生导师，主要从事园林植物遗传育种研究。 E-mail:lyl6151@126.com e Edition,2009,30(3):16-21.(in Chinese)

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.006

S682.2+65

A

1671-9387(2015)03-0105-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.006.html