响应面法优化促孕灌注液中总黄酮的提取工艺

卢朝成，符华林，范巧佳，张 伟，舒 刚，周 涛，张艳丽，刘梦娇

(四川农业大学 动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014)

响应面法优化促孕灌注液中总黄酮的提取工艺

卢朝成，符华林，范巧佳，张 伟，舒 刚，周 涛，张艳丽，刘梦娇

(四川农业大学 动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014)

【目的】 采用响应面法优化促孕灌注液中总黄酮的提取工艺，为促孕灌注液总黄酮的实际生产提供参考。【方法】 采用水煎醇沉法制备促孕灌注液，以总黄酮得率为指标，在单因素试验的基础上，采用响应面的中心组合设计，考察液(mL)料(g)比(下同)、煎煮时间、提取次数3个因素对促孕灌注液中总黄酮得率的影响，对总黄酮的提取工艺参数进行优化分析。【结果】 单因素试验结果表明，最佳浸泡时间为10 min，液料比为15∶1，煎煮时间为30 min，提取次数为3次。选择对总黄酮得率影响明显的液料比、煎煮时间、提取次数3个因素进行响应面优化分析试验，得到总黄酮最优提取条件为：液料比17.5∶1，煎煮38 min，提取3次。在最优提取工艺条件下，促孕灌注液总黄酮的理论得率为14.082 mg/g，实测得率为14.193 mg/g，二者误差较小。【结论】 优化得到了促孕灌注液中总黄酮提取工艺，该工艺稳定、重复性好、总黄酮得率高。

促孕灌注液；总黄酮；提取工艺；响应面优化；水煎醇沉法

促孕灌注液为《中国兽药典》(2010年版第2部)收录的成方制剂，由淫羊藿、红花和益母草3味中药通过水煎醇沉法制备而成，是防治母畜卵巢静止和持久黄体不孕症的中药成方制剂。经临床证明，该制剂治疗效果确切、治愈率高、不良反应小、耐药率低，因而受到越来越多的关注[1-2]。黄酮是促孕灌注液中的主要成分，有激素样作用[3-5]。有研究表明，促孕灌注液中的黄酮有促进子宫生长和卵巢排卵的作用[6-7]。

目前对促孕灌注液的研究较多[2,7]，也已有不同提取工艺的研究报道[8-9]。如周淑贞等[10]考察了不同提取方法对促孕灌注液中有效成分含量的影响，认为半仿生醇沉法能够提高有效成分的含量。水煎醇沉法是《中国兽药典》中促孕灌注液的法定提取方法，但这种方法对促孕灌注液总黄酮的提取效率如何尚未见研究报道。本研究采用紫外分光光度法测定促孕灌注液中的总黄酮含量，利用单因素试验分析水煎醇沉法提取促孕灌注液中黄酮类化合物的主要影响因素，并采用响应面法[11-12]优化提取工艺，以期得到促孕灌注液总黄酮的最优提取条件，进而为其实际生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪 器

UV-2102P型分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；电子天平，沈阳龙腾电子有限公司。

1.2 材 料

淫羊藿，四川洪雅县瓦屋山药业有限公司，批号：120401；红花，四川御鼎堂中药饮片有限公司，批号：465120901；益母草，四川洪雅县瓦屋山药业有限公司，批号：120601；以上药材经四川农业大学范巧佳副教授鉴定均为正品药材。芦丁标准品，中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707；无水三氯化铝，天津市福晨化学试剂厂，批号：20121102。其他试剂均为分析纯。

1.3 总黄酮测定方法的建立

采用紫外分光光度法测定促孕灌注液中的总黄酮。精密称定芦丁标准品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，加体积分数60%乙醇适量，水浴微热溶解，放冷至室温，用体积分数60%乙醇定容，配制成质量浓度为200 μg/mL的芦丁母液。吸取芦丁母液1.25，1.50，1.75，2.00，2.25，2.50，2.75 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加l mol/L三氯化铝溶液1.00 mL，再加体积分数60%乙醇至刻度，摇匀，使芦丁标准液最终质量浓度分别为10，12，14，16，18，20和22 μg/mL，以不加芦丁母液的溶液为空白对照，于415 nm处测定吸光度，以芦丁质量浓度为横坐标(x)、吸光度为纵坐标(y)进行回归分析，得到标准曲线回归方程。

1.4 供试品中总黄酮的测定

精密吸取制备的促孕灌注液供试品100 μL置于10 mL容量瓶中，用体积分数60%乙醇定容，摇匀；取1 mL样品于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L三氯化铝溶液1 mL，加体积分数60%乙醇溶液至刻度，摇匀，以不加样品的溶液为空白对照，于415 nm处测定吸光度，将其代入标准曲线方程，计算总黄酮的质量浓度，并按以下公式计算提取物中总黄酮的得率(Y，mg/g)：

式中：c为供试品溶液中总黄酮的质量浓度，μg/mL,由回归方程计算；a为测定时提取液的稀释倍数；V为提取液的总体积,mL；m为3味药材的总质量,g。

1.5 促孕灌注液的制备

称取淫羊藿4.0 g、益母草4.0 g、红花2.0 g于300 mL烧杯中，加入适量的蒸馏水，浸泡一定时间后，按不同提取次数和提取时间煮沸提取，纱布过滤，合并提取液，浓缩，放冷，加入一定量的乙醇除去杂质，抽滤，除去滤液中的乙醇，加蒸馏水到10.0 mL，即得促孕灌注液。

1.6 促孕灌注液中总黄酮提取的单因素试验

按照1.5节方法，保持其他条件不变，分别考察浸泡时间、液(mL)料(g)比(下同)、煎煮时间和提取次数对总黄酮得率的影响。

(1)浸泡时间。固定液料比为10∶1，煎煮10 min，提取2次，考察不同浸泡时间(0，10，20，30，40 min)对总黄酮得率的影响。

(2)液料比。固定浸泡时间为10 min，煎煮10 min，提取2次，考察不同液料比(10∶1，12.5∶1，15∶1，17.5∶1，20∶1)对总黄酮得率的影响。

(3)煎煮时间。固定浸泡时间为10 min，液料比为15∶1，提取2次，考察不同煎煮时间(10，20，30，40，50 min)对总黄酮得率的影响。

(4)提取次数。固定浸泡时间为10 min，液料比为15∶1，煎煮10 min，考察不同提取次数(1，2，3，4，5次)对总黄酮得率的影响。

1.7 响应面法优化促孕灌注液中总黄酮的提取工艺

为了分析各因素之间的交互作用对促孕灌注液中总黄酮得率的影响，以确定最佳的提取工艺，根据Box-Behnken试验设计原理，运用Design Expert 8.05b设计响应面试验，在单因素试验结果的基础上，分别以液料比、煎煮时间、提取次数这3个因素进行三因素三水平组合试验，共计17个试验组合，试验因素及水平见表1。每个自变量的低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码，以总黄酮得率为指标确定最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 总黄酮测定方法的建立

以芦丁质量浓度为自变量x、吸光度为因变量y进行回归分析，得到标准曲线回归方程为：y=0.024 6x+0.017 4，R2=0.999 3，在x=10～22 μg/mL线性关系良好。日内和日间精密度及回收率测算结果(表2)表明，该测定方法稳定，重复性高。

2.2 浸泡时间对促孕灌注液中总黄酮得率的影响

如图1显示，浸泡时间对促孕灌注液中总黄酮得率的影响不明显，这可能是由于细胞内的总黄酮等有效成分因细胞壁的影响不易扩散到提取液中所致。但是为了尽量使药材表面润湿，为加热时有效成分的扩散提供条件，浸泡时间以10 min为宜。

2.3 液料比对促孕灌注液中总黄酮得率的影响

图2结果表明，当液料比达到15∶1之前，随着液料比的增加，总黄酮得率变化较大。这可能是在一定范围内，液料比的增加使得提取过程中的浓度差增加，药物易于从药材组织中扩散出来[13]；但是随着液料比的进一步增加，提取液的增加使浓缩时间延长，总黄酮因长时间受热被破坏，使得其得率未能明显增加[14]。所以本着节约资源和控制生产成本的原则，选择液料比为15∶1。

2.4 煎煮时间对促孕灌注液中总黄酮得率的影响

图3表明，在煎煮10～50 min时,随着煎煮时间的延长，促孕灌注液总黄酮得率呈先增加后降低的变化趋势，其中以煎煮时间为30 min时提取效果最好。这可能是因为随着煎煮时间的进一步延长，其中的黄酮类物质因长时间受热而分解[15]所致。

2.5 提取次数对促孕灌注液中总黄酮得率的影响

由图4可以看出，提取次数为1～3次时，随提取次数增加，促孕灌注液总黄酮得率持续增加。提取次数为4次和5次时，总黄酮得率与提取3次时相比略有下降。考虑到增加提取次数可使提取液体积增加，导致浓缩时工作量增加，从而增加生产成本，所以提取次数以3次为宜。

2.6 促孕灌注液总黄酮提取工艺的响应面法优化

由单因素试验结果可知，浸泡时间对促孕灌注液中总黄酮提取影响不大，因此选取对总黄酮提取影响显著的液料比(A)、煎煮时间(B)、提取次数(C)为变量，以总黄酮得率为响应值，进行响应面分析试验，结果见表3。

利用Design Expert 8.05b软件对表3试验数据进行多元回归拟合。得到促孕灌注液中总黄酮的得率(Y)对液料比(A)、煎煮时间(B)、提取次数(C)的二次多项回归模型为：总黄酮得率(Y,mg/g)=14.11+0.16A+0.27B+0.60C+0.21AB+0.056AC+0.099BC-0.55A2-0.36B2-0.66C2。方程回归分析及促孕灌注液中总黄酮提取的响应面试验结果的方差分析结果见表4。

对各项进行F检验，P<0.05为显著项，P<0.01为极显著项。由表4方差分析结果可知，模型F值为4.957 163，0.01F=0.023 2<0.05，表明该模型显著，不同处理间差异显著，说明试验结果合理，回归方程在试验点上与结果拟合较好。模型相关系数R2=0.864 4，说明此模型与实际试验拟合较好；试验失拟项小，说明试验方法可靠，能够很好地描述试验结果，使用该方程代替真实的试验点进行分析是可行的；其中C、A2、C2项对总黄酮得率的影响显著，由此可以看出试验因素对响应值的关系不是简单的线性关系[16]，二次项也对响应值有很大的影响，根据方程所绘制的响应面图和等高线图见图5～7。

图5显示，促孕灌注液总黄酮得率受液料比与煎煮时间交互作用的影响，当液料比一定时，随着煎煮时间的延长，总黄酮得率先增加达到峰值后又有所减小；当煎煮时间一定时，得率随着液料比的增加也是先增加后减小。图6表明，总黄酮得率受液料比与提取次数交互作用的影响，当液料比(或提取次数)一定时，得率均随着提取次数(或液料比)的增加先提高后降低。图7表明，煎煮时间和提取次数对总黄酮的得率有交互影响，当煎煮时间一定时，总黄酮得率随提取次数的增加先增加后减小；当提取次数一定时，得率随着煎煮时间的增加先增加后减小。

2.7 验证试验

通过Design Expert 8.05b软件求解方程，得到促孕灌注液中总黄酮的最佳提取工艺条件为：液料比17.5∶1，煎煮时间37.55 min，提取次数3.55次，此条件下总黄酮理论得率为14.082 mg/g。考虑到实际操作的局限性，将上述试验条件修正为：液料比17.5∶1，煎煮38 min，提取3次。用修正后的试验条件进行3个重复的验证试验，得到总黄酮的平均得率为14.193 mg/g，与预测值基本一致(相对误差仅为0.78%)，表明该方程对实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性。

3 结 论

本研究以促孕灌注液中的总黄酮得率为评价指标，采用响应面法优化实际生产中从促孕灌注液提取总黄酮的工艺条件。最终优化得到的提取工艺为：液料比17.5∶1，煎煮时间38 min，提取次数3次，在该工艺条件下总黄酮的平均得率较高，为 14.193 mg/g。本研究结果为实际生产奠定了基础。

[1] 周淑贞,王德云,张宝康,等.均匀设计法优选新促孕液半仿生提取工艺条件 [J].中草药,2007,38(1):53-55.

Zhou S Z,Wang D Y,Zhang B K,et al.Uniform design new progestational liquid semi-bionic extraction conditions [J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2007,38(1):53-55.(in Chinese)

[2] 李炳奇,邵会娟,谷新利,等.中药复方“促孕散”中总黄酮的提取及其促孕活性研究 [J].黑龙江畜牧兽医,2011(1):112-114.

Li B Q,Shao H J,Gu X L,et al.Chinese herbal compound “progestational casual” extraction of total flavonoids progestational activity [J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2011(1):112-114.(in Chinese)

[3] 宋环霞,郑天玉.淫羊藿总黄酮对雌性小鼠性器官及相关激素的影响 [J].中国社区医师:医学专业,2012,14(14):6-7.

Song H X,Zheng T Y.Epimediumflavonoids on female mice organs and related hormones [J].Chinese Community Doctors:Medical Speciality,2012,14(14):6-7.(in Chinese)

[4] 张 磊,王 岚,吴 瑕,等.淫羊藿总黄酮对不同性别大鼠性器官及相关激素的影响 [J].中药药理与临床,2009,25(1):31-33.

Zhang L,Wang L,Wu X,et al.Epimediumflavonoids in rats of different sex organs and related hormones [J].Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica,2009,25(1):31-33.(in Chinese)

[5] 刘 蕊.黄酮类化合物的药理作用研究进展 [J].黑龙江医药,2010,23(2):234-236.

Liu R.Research progress of flavonoid compound [J].Heilongjiang Medicine Journal,2010,23(2):234-236.(in Chinese)

[6] 刘勤兴,李炳奇,邵会娟,等.促孕灌注液中黄酮对小白鼠卵巢、子宫及激素的影响 [J].西北农业学报,2010,19(5):32-34.

Liu Q X,Li B Q,Shao H J,et al.Effects of flavonoids in fertility-promoting intrauterine infusion liquid on ovaries,hystera and hormone of mus musculus albus [J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,2010,19(5):32-34.(in Chinese)

[7] 李炳奇,刘勤兴,邵会娟,等.“促孕灌注液”中黄酮对不孕大鼠模型促排卵作用机制 [J].西北农业学报,2011,20(2):44-47.

Li B Q,Liu Q X,Shao H J,et al.The flavones of fertility-promoting intrauterine infusion liquid in ovulation promoting to sterile rats [J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,2011,20(2):44-47.(in Chinese)

[8] 张宝康,胡元亮,刘家国,等.新型促孕灌注液质量控制方法的研究 [J].中国兽药杂志,2000,34(1):19-21.

Zhang B K,Hu Y L,Liu J G,et al.New FPL perfusion fluid quality control method [J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2000,34(1):19-21.(in Chinese)

[9] 李炳奇,谷新利,夏新福,等.中药复方“促孕散”中黄酮类化合物的提取及含量测定方法研究 [J].畜牧兽医杂志,2010,29(6):1-3.

Li B Q,Gu X L,Xia X F,et al.Study on extraction and determination of flavanone component from fertility-promoting intrauterine infusion powder (FPP) [J].Journal of Animal Science and Veterinary Medicine,2010,29(6):1-3.(in Chinese)

[10] 周淑贞,胡元亮,张宝康,等.不同提取方法对新型促孕灌注液有效成分含量的影响 [J].福建农林大学学报:自然科学版,2007,36(3):288-291.

Zhou S Z,Hu Y L,Zhang B K,et al.Effects of different extraction methods on effective component content of new fertility-promoting intrauterine infusion liquid [J].Journal of Fujian Agriculture and Forestry University：Natural Science Edition,2007,36(3):288-291.(in Chinese)

[11] 雷 婷,林翠梧,陈海燕,等.响应面法优化滇桂艾纳香中绿原酸的提取工艺 [J].华西药学杂志,2008,23(6):630-632.

Lei T,Lin C W,Chen H Y,et al.Optimization of the extraction technique of chlorogenic acid inBlumearaparia(Bl.) DC.by response surface method [J].West China Journal of Pharmaceutical Sciences,2008,23(6):630-632.(in Chinese)[12] 肖 莉,张韵慧.星点设计-效应面法优选南五味子的提取工艺 [J].中国实验方剂学杂志,2010,16(10):22-25.

Xiao L,Zhang Y H.Optimal extraction of effective constituents fromSchisandrasphenantheraby central composite design/response surface methodology [J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2010,16(10):22-25.(in Chinese)

[13] Chen L,Ding L,Yu A,et al.Continuous determination of total flavonoids inPlatycladusorientalis(L.) Franco by dynamic microwave-assisted extraction coupled with on-line derivatization and ultraviolet-visible detection [J].Analytica Chimica Acta,2007,596(1):164-170.

[14] 蔡 健,华景清,王 薇,等.黄酮提取工艺研究进展 [J].淮阴工学院学报,2003,12(5):82-85.

Cai J,Hua J Q,Wang W,et al.Progress in research of the extracting technology of biofiavonoids [J].Journal of Huaiyin Institute of Technology,2003,12(5):82-85.(in Chinese)

[15] 莫开菊,程 超,黄 鹏,等.生姜黄酮提取纯化及结构的初步鉴定 [J].食品科学,2005(9):211-215.

Mo K J,Cheng C,Huang P,et al.Study on extraction technology,purification and structural appraisal of flavonoid from ginger [J].Food Science,2005(9):211-215.(in Chinese)

[16] Zheng H,Hwang I,Kim S,et al.Optimization of carbohydrate-hydrolyzing enzyme aided polyphenol extraction from unripe apples [J].Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2010,53(3):342-350.

Optimization of total flavonoids extraction from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid using response surface methodology

LU Chao-cheng,FU Hua-lin,FAN Qiao-jia,ZHANG Wei,SHU Gang, ZHOU Tao,ZHANG Yan-li,LIU Meng-jiao

(CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 This study estimated the optimal conditions for total flavonoids extraction from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid based on response surface methodology to provide theoretical foundation for its further processing and utilization.【Method】 The Fertility-promoting intrauterine infusion liquid was prepared by decoction and alcohol precipitation.On the basis of single factor test,response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions including water (mL)-feed (g) ratio (the same below),boiling time,and extraction times.【Result】 The optimum soaking time,water-feed ratio,boiling time,and extraction times based on single factor test were 10 min,15∶1,30 min,and 3 times,respectively.The water-feed ratio,boiling time and extraction times that had significant effects on the extraction rate of total flavonoids were selected for response surface optimization test.The optimal water-feed ratio,boiling time,and extraction times were 17.5∶1,38 min,and 3 times,respectively.The predicted extraction rate of 14.082 mg/g was very close to observed rate of 14.193 mg/g.【Conclusion】 The optimized extraction process was stable,reproducible,and had high total flavonids yield from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid.

Fertility-promoting intrauterine infusion liquid;total flavonoids;extraction of condition;response surface optimization;decoction and alcohol precipitation

2013-10-22

教育部长江学者和创新团队发展计划创新团队基金项目(IRT0848)；四川农业大学“优秀硕士论文培育基金”项目

卢朝成(1987-)，男，四川龙泉驿人，在读硕士，主要从事药物新剂型研究。E-mail:luchaocheng712@sina.com

符华林(1972-)，男，四川华蓥人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事药物新剂型与新制剂研究。 E-mail:fuhl2005@sohu.com

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.022

S853.76;R944.1

A

1671-9387(2015)03-0007-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.022.html