‘雪球’海棠组织培养体系的建立与优化

王冰洁，李厚华，阙 怡，魏新翠，王亚杰

(1 西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌712100；2 重庆大学城市科技学院 建筑学院，重庆402167)

‘雪球’海棠组织培养体系的建立与优化

王冰洁1，李厚华1，阙 怡2，魏新翠1，王亚杰1

(1 西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌712100；2 重庆大学城市科技学院 建筑学院，重庆402167)

【目的】 建立‘雪球’海棠离体植株组织培养快繁体系，并对组织培养体系进行优化。【方法】 以‘雪球’海棠当年生茎段为起始接种材料，获得无菌苗，利用无菌苗和试管苗叶片为材料，以MS为基础培养基，采用正交试验研究不同激素及其配比对雪球组培苗扩繁、植株再生和组培苗生根的影响。【结果】 用2 g/L HgCl2处理‘雪球’海棠茎段外植体是较为恰当的消毒及获得无菌苗的方法。在MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培养基中组培苗的总增殖倍数最高，为9.11，为最适增殖培养基；在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培养基中组培苗的总增殖倍数为6.38，分化的芽生长良好，无玻璃化，为获取叶盘不定芽再生试验用叶片的最适培养基。在MS+0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培养基(以山梨醇为碳源)中，叶盘不定芽再生效率最高，为60.71%，为不定芽再生最适培养基。‘雪球’海棠生根容易，在1/2 MS+0.2 mg/L IBA培养基中，组培苗培养7 d开始生根，生根率为100.0%。【结论】 建立了‘雪球’海棠组织培养体系，明显提高了其繁殖速率，使其生根率可达到100.0%。

‘雪球’海棠；组织培养；植株再生；生根诱导

‘雪球’海棠(Malus‘Snow drift’)为蔷薇科苹果属植物，是中国从美国引进的白色花海棠品种，其树形整齐、均匀，树冠开展，株型紧凑，叶色鲜亮，春夏两季绿意盎然；花苞淡粉色，花期4月中下旬，花开后纯白色，花团锦簇，远观如一团雪球，甚是可爱，丛植和孤植观赏效果俱佳[1]。‘雪球’海棠果实成熟时呈亮桔红色，可食用，观果期长，从8月至冬季，落叶后一簇簇红色的果子挂满枝头，不仅观赏价值很高，还可以为庭园吸引鸟类。另外，‘雪球’海棠抗寒性和抗旱性均较好[2-3]，抗病能力强，是园林绿化及美化环境的优良品种，具有很好的市场前景。但是由于该种是近年才从国外引进的品种，繁殖主要依赖于枝条的嫁接，繁殖速度很慢，成本高、效率低，不能满足国内需求[1]，而植物组培快繁技术是解决此类问题的最有效途径。目前关于苹果的组织培养研究已经取得了一些成果[4]，但对海棠组织培养的研究较少。本试验在借鉴苹果组织培养研究成果的基础上，对‘雪球’海棠组织培养体系的建立与优化进行了研究，以期为‘雪球’海棠的快速繁殖及实现工厂化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

10年生以上‘雪球’海棠健康且带有饱满腋芽的当年生枝条，采自北京植物园海棠栒子园。

1.2 外植体消毒

去掉‘雪球’海棠枝条上的叶片，仅保留一小段叶柄，流水冲洗1 h，置于添加Tween 20(每升2～3滴)的无菌水中搅拌浸泡30 min，在超净工作台上用体积分数75%酒精消毒1 min，无菌水清洗2次，再分别用1和2 g/L的HgCl2处理8 min，无菌水清洗3次，备用。

1.3 初代培养获取无菌苗

将经消毒处理的‘雪球’海棠枝条切成1～2 cm带1个腋芽的茎段，接种到用于苹果扩繁的培养基(MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA)上，30 d后统计褐化率、污染率、出芽率及成活率。将萌发后的无菌茎段接种到相同培养基上进行初代培养，以获得足够的无菌苗进行扩繁培养基的优化。

1.4 6-BA及IBA对‘雪球’海棠组培苗增殖的影响

选择初代培养获得的健壮的‘雪球’海棠无菌苗作为试验材料，以MS(30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH 5.8)为基础培养基，添加不同质量浓度6-BA(0.5，1.5，2.5 mg/L)与IBA(0.1，0.2，0.3 mg/L)，进行正交试验组合设计，另设置3个对照组，分别为MS、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L IBA。试验共设置12种组合，每种组合接种15株组培苗，重复3次。培养条件：温度(23±2) ℃，光照强度2 000 lx，光周期为光照16 h/黑暗8 h。30 d后统计增殖及植株生长情况。

总增殖倍数=总扩增的组培苗数/原接种的组培苗数，增殖倍数=(新增组培苗数+接种组培苗数)/原接种的组培苗数。株高用坐标纸测量。

对组培苗的健康指数进行统计，健康指数分为3个等级：1级.扩增组培苗玻璃化，植株水渍状或植株叶片枯黄死亡；2级.组培苗无玻璃化，但茎干细弱，叶片过小或过大老化，可用于扩繁但不能取叶再生；3级.扩增组培苗生长健壮，叶片大小适中，叶片鲜绿[5]。

1.5 TDZ及NAA对叶盘不定芽再生的影响

选择继代培养30 d左右长出的健壮组培苗，取其顶部完全展开的最幼嫩叶片，切成0.5 cm2的叶盘，生理正面向下培养。再生培养基以MS(7 g/L琼脂，pH 5.8)为基础培养基，以30 g/L山梨醇替换蔗糖作为碳源[6-7]，添加不同质量浓度的TDZ(0.2，0.6，1.0，1.5 mg/L)与NAA(0.1，0.3，0.5 mg/L)，将二者进行正交试验组合设计，共设置12种组合。每种组合15 个叶盘，重复3次。23 ℃下暗培养2周[8],诱导出愈伤组织后转入光照(2 000 lx，光照16 h/黑暗8 h)下培养进行不定芽分化。每2周更换1次培养基。14 d后统计愈伤组织诱导情况，60 d后统计不定芽分化情况。

将愈伤组织分为4个等级：0级.无愈伤组织；1级.仅在主叶脉的切口处有极少量愈伤组织；2级.仅在一端切口处诱导出大量愈伤组织，另一端愈伤量较少或无；3级.两端切口处均长满致密的愈伤组织[5]。愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的叶盘数/接种叶盘总数×100%；叶盘再生效率=再生出芽的叶片数/接种叶片数×100%。

1.6 IBA对生根的影响

以继代培养30～35 d后长出的1.5 cm以上的健壮组培苗为材料进行生根诱导。以1/2 MS(30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH 5.8)为基础培养基[5,9]，添加不同质量浓度的IBA(0，0.1，0.2，0.3 mg/L)，每处理9株苗，重复3次。出根前在室内自然光下培养，出根后移至正常组培光照(2 000 lx)下培养，40 d后统计生根率及根生长情况。生根率=(生根的组培苗数/接种组培苗数)×100%。

1.7 数据分析方法

采用SPSS 18.0统计软件对试验数据进行方差分析和多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度HgCl2对‘雪球’海棠外植体消毒效果的比较

本研究共接种‘雪球’海棠侧芽188个，结果(表1)表明，用2 g/L HgCl2处理‘雪球’海棠侧芽外植体的污染率比1 g/L HgCl2处理低，且污染主要发生在接种后的前10 d，在接种后10～20 d时污染率增加幅度明显变小；而用1 g/L HgCl2处理的材料在接种后20 d内持续有污染；接种20 d后，2和1 g/L HgCl2处理的材料污染率均不再增加。2种HgCl2处理下，材料的褐化率均为0。2 g/L HgCl2处理的出芽率和成活率是1 g/L HgCl2处理的1.58倍和1.86倍。表明用2 g/L HgCl2处理‘雪球’海棠侧芽外植体，其消毒及获得无菌苗的效率比用1 g/L HgCl2处理高，所以2 g/L HgCl2应较为适宜用于‘雪球’海棠茎段外植体的消毒(图1-A)。

图1 ‘雪球’海棠的组织培养
A.茎段外植体腋芽萌发；B.茎段愈伤组织诱导的不定芽；C.组培苗腋芽萌发芽；D.扩繁培养基K3组中的组培苗；E.再生培养基Z1组中再生的叶盘不定芽；F.生根培养基R2中组培苗的生根情况
Fig.1 Tissue culture ofMalus‘Snow drift’
A.Stem segment explants germinated axillary buds;B.Adventitious buds from callus induction;C.Adventitious buds from tissue-cultured axillary buds;D.Seedlings cultured in the propagation medium K3;E.Leaf dish adventitious buds regeneration cultured in regeneration medium Z1;F.Seedlings cultured in rooting medium R2

2.2 6-BA及IBA配比对‘雪球’海棠组培苗增殖的影响

‘雪球’海棠扩繁苗有2种发生途径：一是通过茎端愈伤组织诱导芽(图1-B)；二是通过腋芽直接萌发芽(图1-C)。培养30 d后的结果(表2)表明，当IBA质量浓度相同时，总增殖倍数随着6-BA质量浓度的增加呈增大趋势，腋芽萌发芽的增殖倍数也随6-BA质量浓度的增加而明显增大，但茎端愈伤组织诱导芽的增殖倍数随6-BA质量浓度的增加变化规律不明显；在不含6-BA的培养基中没有愈伤组织诱导芽的产生，而是诱导植株生根，并且植株粗壮、叶大，说明IBA对‘雪球’海棠有促进生根的作用。当6-BA质量浓度相同时，随着IBA质量浓度的增加，2种方式扩繁的新生苗的苗高均呈递增趋势。无论是愈伤组织诱导芽还是腋芽萌发芽长成的组培苗，在IBA质量浓度相同时，在高质量浓度6-BA培养基中的组培苗苗高较低质量浓度6-BA培养基中的矮，说明高质量浓度6-BA有抑制组培苗增高的趋势。腋芽萌发芽的健康指数明显比茎端愈伤组织诱导芽高。在K9组中，‘雪球’海棠组培苗的总增殖倍数为9.11，茎端愈伤组织诱导芽和腋芽萌发芽的健康指数均为2，为最适增殖培养基。在K3组中，组培苗的总增殖倍数为6.38，愈伤组织诱导芽的健康指数为2，腋芽萌发芽的健康指数为3，且2种组培苗均为同系列中最高(图1-D)，因此K3组为获取叶盘不定芽再生试验叶片的最适培养基。

注：同列数据后标不同小写字母者表示用Duncan’s法检测在P<0.05水平上差异显著，下表同。*.生根率(%)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference by Duncan’s test atP<0.05.The same below.* indicates rooting rate (%).

2.3 TDZ及NAA配比对‘雪球’海棠离体叶盘不定芽再生的影响

14 d暗培养后，不同质量浓度TDZ和NAA组合的12种处理均能诱导出愈伤组织，且愈伤组织诱导率均能达到100%。培养60 d时叶盘再生情况见表3。

由表3可知，不同质量浓度TDZ和NAA配比处理对‘雪球’海棠叶盘再生效率和平均再生芽数均影响显著。当NAA质量浓度相同时，在TDZ质量浓度小于1.0 mg/L时，随TDZ质量浓度的增加，叶盘再生效率整体呈现增长趋势，但当TDZ质量浓度达到1.5 mg/L时，叶盘再生效率显著减小。在Z1组中，叶盘再生效率最高，为60.71%；在Z9组中,叶平均再生芽数最多，为5.78个，显著高于其他组别，但本组叶盘再生效率却低于Z1组。综合考虑，选择Z1组为最适的‘雪球’海棠离体叶盘不定芽再生培养基(图1-E)。

2.4 IBA对‘雪球’海棠组培苗生根的影响

将健康的‘雪球’海棠组培苗接种到含不同质量浓度IBA的培养基中，于室内自然光下培养后，最早5 d开始生根。40 d后的生根培养结果(表4)表明，‘雪球’海棠生根容易，当IBA质量浓度为0.2 mg/L时，生根率达到了100.0%(图1-F)；在不含IBA的培养基中，‘雪球’海棠的生根率较低，出根时间长且须根少；在含有IBA的培养基中，组培苗生根率均较高，且低质量浓度(0.1～0.2 mg/L)的IBA有利于须根的生长，随着IBA质量浓度的升高出根时间逐渐延迟。综合考虑，选择1/2 MS+0.2 mg/L IBA为‘雪球’海棠最适生根培养基。

3 讨 论

‘雪球’海棠组培苗的扩增有2种发生途径：通过茎端愈伤组织诱导不定芽或通过腋芽直接萌发芽。已有的研究表明，绝大多数苹果属植物均是通过前一种途径诱导分化芽进行扩增[8,10-11]，通过诱导腋芽萌发芽进行扩增的途径报道较少，在已有报道中，苹果属组培苗需切掉茎尖去除顶端优势才会刺激腋芽生长[12-13]。而本试验中‘雪球’海棠组培苗不需去除顶端优势即可直接使侧芽萌发成苗。‘雪球’海棠腋芽易萌发的特性，一方面可显著提高扩增效率；另一方面愈伤组织诱导芽要经过脱分化再分化的过程，而腋芽萌发芽直接从原植株的芽萌发，这能够降低突变发生的概率，有利于植株优良性状的保持。此外，在筛选的最适增殖培养基中，通过腋芽萌发产生的芽不会出现玻璃化问题，其健康指数均高于相同培养条件下由愈伤组织诱导产生的芽，所以在‘雪球’海棠组培苗扩繁或保存过程中，可优先选择腋芽萌发产生的植株作为材料。

基因型是影响苹果属离体叶盘再生的关键因素，即苹果属不同种或不同品种在相似的培养条件下，其再生的难易程度及再生效率差异很大[4,11,14]。本研究对‘雪球’海棠离体叶盘不定芽再生的优化试验结果表明，随着TDZ和NAA质量浓度的变化，叶盘再生效率和平均再生芽数呈现一定变化规律，且在一定的激素质量浓度比(TDZ与NAA质量浓度比为2∶1)下，叶盘再生效率高于其他组合，这与吴雅琴等[14]的研究结果相似，而与其他研究结果相差较大[4,11]。

苹果属植物嫁接繁殖速度慢，扦插繁殖生根率低[15]，种子繁殖不能保持亲本的优良性状，普通繁殖方法不能实现快速繁殖。而本试验建立的‘雪球’海棠快繁体系扩繁效率高，总增殖倍数最高可达9.11；组培苗生根容易，在优化的生根培养基中其生根率可达到100.0%，极大地提高了‘雪球’海棠的繁殖速率，为‘雪球’海棠的快速繁殖和工业化生产提供了很好的理论依据。

园林应用中的海棠种类繁多，但是花色多为红色系或白色，没有黄色系。笔者曾经尝试通过基因工程调控红色花海棠中黄色色素的生物合成，化学分析结果表明，黄色色素合成增加，但因为黄色被红色所覆盖，花未能呈现黄色(未发表)。由于‘雪球’海棠花色为白色，所以它可以作为海棠花色研究的良好材料。本试验建立的‘雪球’海棠组织培养体系为进一步通过基因工程进行海棠花色研究奠定了基础。

[1] 孙 宜. ‘雪球’海棠的组织培养和快速繁殖 [J].植物生理学通讯,2000,36(1):42.

Sun Y.Tissue culture and rapid propagation ofMalus‘Snow drift’ [J].Plant Physiology Communications,2000,36(1):42.(in Chinese)

[2] 刘珠琴,黄宗兴,舒巧云,等．北美海棠新品种的引进与栽培表现 [J].中国园艺文摘,2010(10):41-42.

Liu Z Q,Huang Z X,Shu Q Y,et al.Introduction and cultural performance of North American Crabapple [J].Chinese Horticulture Abstracts,2010(10):41-42.(in Chinese)

[3] 张 丽．北美海棠品种间耐热性比较 [J].江苏农业科学,2012,40(9):175-176.

Zhang L.Heat resistance between different species of North American Crabapple [J].Jiangsu Agricultural Sciences,2012,40(9):175-176.(in Chinese)

[4] 郝红梅,田 义,丛佩华,等.苹果离体叶片植株再生研究进展 [J].中国果树,2011(1):55-60.

Hao H M,Tian Y,Cong P H,et al.Progress of appleinvitrotissue culture [J].China Fruits,2011(1):55-60.(in Chinese)

[5] 阙 怡,李厚华,付婉艺,等.西府海棠组织培养体系的建立与优化 [J].东北林业大学学报,2013,41(5):86-89.

Que Y,Li H H,Fu W Y,et al.Establishment and optimization of tissue culture and adventitious shoot regeneration onMalusmicromalus[J].Journal of Northeast Forestry University,2013,41(5):86-89.(in Chinese)

[6] 马锋旺,王 飞.山梨醇作碳源对苹果微体繁殖的效应 [J].西北农业大学学报,1996,24(4):102-104.

Ma F W,Wang F.Effect of sorbitol as carbon source on micropropagation of apple [J].Journal of Northwestern Agricultural University,1996,24(4):102-104.(in Chinese)

[7] 李嘉瑞,马锋旺.蔷薇科果树山梨醇的研究 [J].果树科学,1991,8(2):111-115.

Li J R,Ma F W.Study on sorbitol of Rosaceae trees [J].Journal of Fruit Science,1991,8(2):111-115.(in Chinese)

[8] 师校欣,杜国强,高 仪,等.黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的影响 [J].河北农业大学学报,2004,27(4):18-21.

Shi X X,Du G Q,Gao Y,et al.The effect of darkness culture on micropropagation and adventitious bud generation from leaf in apple [J].Journal of Agricultural University of Hebei,2004,27(4):18-21.(in Chinese)

[9] Druart P.Optimization of culture media forinvitrorooting ofMalusdomesticaBorkh.cv.Compact Spartan [J].Biologia Plantarum,1997,39(1):67-77.

[10] 裴轶琨,李晓玲,李克秀,等.‘霍巴’海棠组培快繁技术研究 [J].北方园艺,2011(10):124-127.

Pei Y K,Li X L,Li K X,et al.Study on rapid propagation ofMalus‘Hopa’ by tissue culture [J].Northern Horticulture,2011(10):124-127.(in Chinese)

[11] 李厚华,阙 怡,费昭雪,等.红果肉苹果组织培养及转基因体系的建立与优化 [J].北方园艺,2011(15):175-179.

Li H H,Que Y,Fei Z X,et al.Establishment and optimization of tissue culture and genetic transformation system ofMalussieversiivar.niedzwetzkyana[J].Northern Horticulture,2011 (15):175-179.(in Chinese)

[12] Judit D,Jaime A.Micropropagation of apple:A review [J].Biotechnology Advances,2010,28:462-488.

[13] Shammi B,Gopalijee J.Current trends and future prospects of biotechnological interventions through tissue culture in apple [J].Plant Cell Rep,2010,29:1215-1225.

[14] 吴雅琴,赵艳华,李春敏．昌红苹果离体叶片不定芽的诱导及植株再生 [J].云南农业大学学报,2006,21(1):32-35.

Wu Y Q,Zhao Y H,Li C M.Efficient adventitious bud induction and plant regeneration from leavesinvitroof apple (cv.Changhong) [J].Journal of Yunnan Agricultural University,2006,21(1):32-35.(in Chinese)

[15] 王甲威,张道辉,魏海荣,等.苹果矮化砧木的硬枝条扦插繁殖试验 [J].落叶果树,2012,44(4):4-6.

Wang J W,Zhang D H,Wei H R,et al.Cuttage propagation by hard branches of apple dwarf rootstock [J].Deciduous Fruits,2012,44(4):4-6.(in Chinese)

Establishment and optimization of tissue culture system forMalus‘Snow drift’

WANG Bing-jie1,LI Hou-hua1,QUE Yi2,WEI Xin-cui1,WANG Ya-jie1

(1CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2CityCollegeofScienceandTechnology,ChongqingUniversity,Chongqing402167,China)

【Objective】 This study aimed to establish and optimize a tissue culture system forMalus‘Snow drift’.【Method】 Stems with buds of Malus ‘Snow drift’ were used as explants to obtain aseptic seedlings.Using aseptic seedlings and leaves as materials and MS as basal medium,orthogonal test was conducted to analyze the effects of hormone on propagation,shoots regeneration and rooting of tissue cultured seedlings.【Result】 The treatment with 2 g/L HgCl2was efficient for disinfecting and obtaining aseptic seedlings.The optimum medium for shoot proliferation was MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA with the average proliferation of 9.11.The optimum medium for healthy leaves was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA with the average proliferation of 6.38,and the health index was highest.The optimum medium for adventitious shoot regeneration was MS+0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA and using sorbitol as carbon source,with the highest regeneration rate of 60.71%.The optimum medium for rooting was 1/2 MS+0.2 mg/L IBA,with the rooting rate of 100.0% after 7 d.【Conclusion】 The established tissue culture system forMalus‘Snow drift’ improved the reproduction rate significantly with the rooting rate of up to 100.0%.

Malus‘Snow drift’;tissue culture;shoots regeneration;root induction

2013-11-04

国家林业公益性行业科研专项(201204308)；高等学校博士学科点专项(20120204120006)

王冰洁(1989-)，女，河北邢台人，在读硕士，主要从事植物分子生物学研究。E-mali：bingjie_wang@nwsuaf.edu.cn

李厚华(1973-)，男，山东济宁人，副教授，硕士生导师，主要从事植物基因工程和类黄酮次生代谢研究。 E-mail:lihouhua73@163.com

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.002

S661.404+.7

A

1671-9387(2015)03-0077-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.002.html