妊娠期糖尿病小鼠表皮生长因子的表达及其意义

张　梅, 王宏兰,张　坤,刘秀财,郭红艳*,李淑艳

(1.齐齐哈尔医学院 生物化学教研室，黑龙江 齐齐哈尔161042;2.齐齐哈尔医学院临床生化教研室;

3.佳木斯出入境检验检疫局，黑龙江 佳木斯154000)

妊娠期糖尿病小鼠表皮生长因子的表达及其意义

张梅1, 王宏兰2,张坤3,刘秀财1,郭红艳1*,李淑艳

(1.齐齐哈尔医学院 生物化学教研室，黑龙江 齐齐哈尔161042;2.齐齐哈尔医学院临床生化教研室;

3.佳木斯出入境检验检疫局，黑龙江 佳木斯154000)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0552)

妊娠期糖尿病( gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期首次发生和发现的不同程度的糖代谢异常。定义包括了孕前糖尿病和孕期发生的糖耐量异常[1]。GDM发病率为1.7%-11.6%[2]。GDM的发生发展对后代会存在深远影响，对母体则会造成危害。GDM的发病机制尚未完全阐明[3,4]。

表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)作为胎盘分泌的重要生长因子，其与胎盘滋养细胞表达的表皮生长因子受体结合进而参与着床的调控，影响胎盘功能，促进滋养细胞的增殖和分化。目前，有关于EGF与GDM之间的关系中，多数报道显示GDM患者血清EGF高于对照组[6]。本研究旨在观察GDM小鼠血清及胎盘中EGF的表达量，以及其与母鼠血糖、新生鼠和胎盘重量之间的关系，以期探讨EGF与GDM之间的因果关系。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1主要试剂链脲佐菌素(STZ)(Sigma)，EGF ELISA试剂盒(上海凯博生化试剂公司)，兔抗小鼠EGF一抗(RD公司，美国)，兔抗小鼠EGFR一抗(Proteintech Group),GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(基因科技上海有限公司)。

1.1.2实验动物C57BL/6，6-8周龄，体重18-20 g,雌性，购自中科院上海实验动物中心。

1.1.3主要仪器石蜡切片机RM2235(Leica)，680型酶标仪(Bio-rad),PCR仪(9600型，PE)，高速台式离心机(上海安亭TGL-16G)。

1.2　方法

1.2.1GDM小鼠模型建立及分组取C57BL/6小鼠，阴道涂片法确定小鼠动情期，按1:2雄雌比例合笼，次晨检查阴道口及垫料，发现乳白色栓子记为妊娠第1天，妊娠第6天早晨开始禁食12 h后GDM组一次性腹腔注射40 mg/kg 的STZ(STZ溶于0.1 mol/L,pH4.2柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液)，对照组注射等量缓冲液。注射后第7天测空腹血糖≥11.1 mmol/L[6]即为造模成功。

1.2.2称量胎鼠和胎盘重量妊娠第18天每各组母鼠剖腹取胎鼠、胎盘称重。死亡胎鼠和死亡母鼠的胎鼠、胎盘不计在内。用滤纸吸干胎鼠和胎盘表面液体，称量。计算胎盘系数：胎盘重量/胎鼠重量。

1.2.3ELISA法测定母鼠血清EGF每组母鼠摘眼球取血，加入肝素钠，离心得到血清标本。按ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.4RT-PCR测定胎盘EGF的表达按Trizol试剂说明提取各组胎盘的总RNA，测定纯度和完整性后按照试剂盒说明进行反转录。引物由上海生物工程有限公司合成。EGF：(f)5′GTGTTATTGGCTATTCTGAG 3′ (r) 5′GGCTCATCACAAGGGTTCT 3′(214 bp)；β-actin：(f)5′TGCTGTCCCTGTATGCCTCT 3′ (r) 5′GATGTCACGCACGATTTCC 3′(221 bp)。PCR反应条件：在95℃ 5 min预变性，94℃45 s，55℃45 s,72℃ 50 s，33个循环，72℃延伸10 min。取扩增产物用1.7%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统定量分析。

1.2.5免疫组化测定胎盘EGF的表达实验步骤按两步法免疫组化试剂盒操作，PBS液代替一抗作为阴性对照。EGF一抗稀释浓度1∶150。镜下观察小鼠胎盘组织EGF分布及表达强度，细胞浆和胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。随机抽取每组5只小鼠切片各1张，每张随机选取5个不重叠视野作分析，Image pro-Plus5.1图像分析软件进行分析，以平均光密度值记录并统计数据。

2结果

2.1　胎盘系数

通过测量胎盘及胎鼠重量利用公式计算，发现两组胎盘系数差异具有统计学意义(P<0.01)。如表1所示。

±s)

注：※#△与对照组相比P<0.01

2.2　母鼠血清EGF含量

GDM组母鼠EGF含量为(173.54±3.64)pg/ml,对照组(135.47±4.98)pg/ml，结果显示GDM组血清EGF含量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3　RT-PCR结果分析

GDM组与对照组胎盘EGFmRNA的表达无统计学意义(P>0.05)，如图1所示。

图1(A)两组胎盘EGFR mRNA的表达。(B)统计学结果显示GDM组和对照组比较EGF mRNA表达无统计学意义(P>0.05)

2.4　免疫组化结果分析

EGF蛋白经过DAB显色后呈棕黄色颗粒，表达于胎盘合体滋养细胞的胞质和胞膜，少量表达在核內。两组小鼠胎盘免疫组化染色经图像分析结果显示，GDM组平均光密度为(0.146±0.005)，对照组为(0.143±0.001)，两组EGF的表达差异无统计学意义(图2，P>0.05)。

3讨论

妊娠期胰岛素抵抗及胰岛β细胞分泌改变被视为GDM发病的重要基础[7]。GDM 患者胰岛素分泌受限，不足以克服胰岛素抵抗而表现为失代偿状态。有研究表明，EGF/EGFR信号转导途径是胰岛β细胞群扩增所必需的[8,9]。本研究发现GDM组血清EGF水平升高，与对照组比较有统计学意义(P<0.01)，与徐金娥等报道的一致[10]。推测GDM患者可能通过提高血清EGF含量来扩增胰岛β细胞群，从而试图克服胰岛素抵抗。有研究推测EGF水平的升高是糖尿病相关性高血糖症胎儿胎盘的代谢反应的结果[11]。因此，我们认为GDM导致了母鼠血清EGF的升高。

图2　两组胎盘免疫组化EGF的表达

妊娠期间EGF与胎儿、胎盘的生长发育密切相关。EGF和EGFR结合后，EGFR进行自我激活引发自身磷酸化反应，进而发挥相应的生物学效应。本研究应用RT-PCR和免疫组化分析胎盘EGF表达,却发现GDM组胎盘EGF表达无论从mRNA还是蛋白水平上都与对照组差异无统计学意义。GDM母鼠血清EGF的增高与胎盘EGF的表达不一致，分析原因可能是胎盘EGF与母体血清EGF来源不同[12]。

本研究GDM组胎盘重量和胎鼠体重、胎盘效率均高于对照组(P<0.01)。胎盘系数是检测胎盘功能的指标，GDM母体血糖通过胎盘屏障诱使胎儿的胰腺释放胰岛素，从而造成胎儿高胰岛素血症[13]。胎儿胰岛素水平的增加能够刺激对胰岛素敏感的胎儿组织的有丝分裂和合成代谢机制，例如肌肉、结缔组织、脂肪组织。我们推测这些也正是GDM组新生鼠体重、胎盘系数超过对照组的原因。

参考文献：

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[10]徐金娥，张宁，杨晓菊等.表皮生长因子与妊娠糖尿病的关系[J].齐鲁医学杂志.2011,26(2):131.

[11]Loukovaara M,Leinonen P,Teramo K,et al.Diabetic Pregnancy Associated With Increased Epidermal Growth Factor in Cord Serum at Term[J].Obstet Gynecol,2004,240:243.

[12]元红，孙宽周，蒋玉红.人表皮生长因子血清水平在孕妇中的变化及临床意义[J].中国优生与遗传杂志,2006,14(7):15.

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摘要：目的探讨妊娠期糖尿病小鼠表皮生长因子的表达与发病的关系。方法采用STZ建立妊娠糖尿病小鼠模型，测定母鼠血糖、胎盘系数；ELISA法测定母鼠血清EGF含量，RT-PCR、免疫组化测定GDM组和对照组胎盘EGF的表达。结果GDM组胎盘系数高于对照组(P<0.01)；GDM组母鼠血清EGF高于对照组(P<0.01)；而RT-PCR和免疫组化结果显示GDM组胎盘EGF表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论GDM导致血清EGF发生变化，而EGF并非GDM发病的原因。

关键词：妊娠期糖尿病；表皮生长因子；表皮生长因子受体

Expression of EGF in GDM mice and its SignificanceZHANGMei，WANGHong-lan，ZHANGKun,etal.(DepartmentofBiochemistry,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161042,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relationship between expression of EGF in gestational diabetes mellitus (GDM)mice and GDM.MethodsSTZ was used to induce GDM in mice,mother mice blood glucose were obtained.The weight of neonatal mouse and placenta were determined immediately after birth.EGF were tested with ELISA in mothers serum.Expression of EGF in placenta were measured by RT-PCR and IHC.ResultsThe weight of neonatal mouse and placenta,placental coefficient of GDM mice was higher than control group(P<0.01)；serum EGF in GDM mice was higher than control group (P<0.01),but the expression of EGF in placenta have no different between GDM and control mice(P>0.05).ConclusionGDM is the reason of change of serum EGF,but it’s not pathogenetic factors of GDM.

Key words:gestational diabetes mellitus;epidermal growth factor;epidermal growth factor receptor

收稿日期：(2014-05-06)

作者简介：张梅,38岁，女，讲师，硕士研究生，研究方向：基因药物的靶向治疗。

文献标识码：A

中图分类号：R587.1

文章编号：1007-4287(2015)04-0552-03

通讯作者*

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521643)