DNA异倍体检测在肺癌早期诊断中的价值

樊　娜　张玉萍　孟　夏　邓文静

明宗娟　石　婕　李　维　史红阳

王　薇　钟玉洁　方　萍　杨拴盈



·论著·

DNA异倍体检测在肺癌早期诊断中的价值

樊娜张玉萍孟夏邓文静

明宗娟石婕李维史红阳

王薇钟玉洁方萍杨拴盈

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命与健康, 而肺癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤之一[1]。近年来，肺癌的发病率呈明显的上升趋势，已成为当今癌症死亡的主要原因[2-3]。而目前肺癌早期诊断率低，仅仅为15%[4]。恶性胸腔积液是肺癌最常见的并发症之一，预后差，中位生存期仅为4个月[5]。国际肺癌研究联合会建议将伴有恶性胸水的非小细胞肺癌定于Ⅳ期[6]。因此，肺癌的早期诊断及胸腔积液良、恶性的鉴别在临床上具有极其重要的意义。临床一般用细胞学检查寻胸水找癌细胞确诊肺癌。但由于细胞学检查工作量大、效率低，且要有专业培训、及有足够工作经验的临床病理专家才能做出确诊。胸水细胞学检查诊断阳性率也仅约60%，而阴性并不能排除肿瘤诊断[7]。DNA异倍体分析原理是：细胞核DNA的测量是通过细胞核积分光密度测定的，主要定量测定细胞或组织化学反应后的最终反应产物的量，并以标准细胞为参照物，计算出定量检测结果，反映细胞核DNA的相对含量[8]。本研究通过将DNA异倍体分析、肿瘤标志物检测结果与细胞学检测结果进行比较，旨在探讨DNA异倍体在肺癌、恶性胸腔积液诊断中的价值。

资料与方法

一、临床资料

收集西安交通大学第二附属医院病理科2013年1月至2014年9月支气管镜刷检、活检、及手术切除病例共280例(男173例、女107例，年龄19～81岁)，胸腔积液399例(男276例，女123例，年龄14～88岁)。所有病例均经活检组织学诊断和/或临床确诊。

二、研究方法

1. 样本取材及制片：采用Olympus BF-1T260型电子纤维支气管镜进行常规刷检和活检，刷取物常规涂片4～6张用10%甲醛常规固定、其余刷取物加入麦克奥迪DNA分析样本处理瓶中固定，活检组织、经皮肺穿活检或术后标本组织样本采用10%甲醛固定、常规制片。

2. 诊断：支气管刷片和活检组织均经HE染色由具有临床资质的病理医师阅片并按照WHO标准进行病理诊断，其中刷片诊断分为：正常、不典型增生、癌疑、癌，以不典型增生、癌疑、癌为阳性判断标准。

3. 细胞DNA定量分析：将固定后的DNA检测样本离心、取沉淀，重悬滴片、自然风干、固定，Feulgen染色，质控片采用大鼠肝细胞片作对照。按照麦克奥迪全自动细胞DNA定量分析系统操作说明进行参数设定、玻片扫描和分析。以DNA指数(DNA Index，DI)表示DNA含量，以DI>2.5判读为异倍体细胞(aneuploidy)，并按①阳性病例：异倍体细胞数≥3个、或可见细胞异倍体峰( 在1.05

三、统计学分析

采用SPSS19.0软件进行χ2检验，以P<0.05表示有统计学差异，同时计算灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。

结果

一、活检、常规支气管刷片、全自动DNA定量分析结果

在该组病例中，活检和临床证实良性病变患者158例(包括支气管黏膜炎141 例、肺结核11例、结节病2例、支气管息肉1例、炎性假瘤1例、肺隔离症1例、矽肺1例)，肺癌患者共122例(包括鳞癌46例、腺癌23例、小细胞未分化癌20例、找到癌细胞但无具体分型者10例和其他经临床诊断23例)；组织病理学检查阴性者占64.64%(181/280)、阳性者(确诊为癌)占35.36%(99/280)；血清癌胚抗原(carcino embryonie antigen, CEA)检测阴性者(≤3.4 ng/ml)占70.71%(198/280)，阳性者(>3.4 ng/ml)占29.29%(82/280)。采用全自动细胞DNA定量分析系统检测发现280例支气管刷检样本中DNA定量分析检测，DI≥3者占22.85%(64/280)、DI为1～2者占11.79%(33/280)、DI为0者占65.36%(183/280)。统计学分析结果显示：全自动细胞DNA定量分析在与组织学检测、细胞学检测及血清CEA检测方法之间比较无统计学差异(P>0.05)。

二、病理活检、常规支气管刷片血清CEA检测与全自动DNA定量技术敏感度和特异度分析

以活检和临床证实的肺癌诊断作为金标准，以活检为阳性值，计算活检的灵敏度为81.1%，特异度为100%；以DI≥1作为阳性界值计算全自动细胞DNA定量分析技术的的灵敏度为60.7%、特异度为85.4%；而在常规纤维支气管刷片中，以不典型细胞、癌疑细胞和癌细胞合计作为阳性细胞计算的常规纤维支气管镜刷片的灵敏度为75.4%、特异度为100%；血清CEA检测的灵敏度为54.1%，特异度为91.8%，见表1。

三、 胸腔积液细胞学检查、全自动DNA定量分析、血清CEA及胸水CEA结果

在该组病例中，活检和临床证实良性病变患者259例(包括结核性渗出性胸膜炎160例、炎性胸腔积液64例、漏出液35例)，恶性胸腔积液患者共140例(包括鳞癌12例、腺癌47例、小细胞未分化癌22例、找到癌细胞但无具体分型者14例和其他经临床诊断者45例)；组织病理学检查阴性者占76.19%(304/399)、阳性者(确诊为癌)占23.81%(95/399)。血清CEA检测阴性者(≤3.4 ng/ml)占69.42%(277/399)，阳性者(>3.4 ng/ml)占30.58%(122/399)；胸水CEA检测阴性者(≤3.4 ng/ml)占67.92%(271/399)，阳性者(>3.4 ng/ml)占32.08%(128/399)。采用全自动细胞DNA定量分析系统检测发现399例胸腔积液样本中DNA定量分析检测，DI≥3者占20.55%(82/399)、DI为1-2者占7.52%(30/399)、DI为0者占71.93%(287/399)。统计学分析结果显示：全自动细胞DNA定量分析在与组织学检测、传统细胞学检测及血清/胸水CEA等检测方法之间均无统计学差异(P>0.05)。

四、 胸水细胞病理学与全自动DNA定量技术及血清、胸水CEA检测敏感度和特异度分析

以活检和临床证实的结果作为金标准，组织病理学的灵敏度为67.9%，特异度为100%；在胸水脱落细胞学检查中，以不典型细胞、癌疑细胞和癌细胞合计作为阳性细胞计算的脱落细胞学检查的灵敏度为83.6%，特异度为100%；以DI≥1作为阳性界值计算全自动细胞DNA定量分析技术的的灵敏度为62.1%、特异度为90.3%；血清CEA检测的灵敏度为75.7%，特异度为93.8%；胸水CEA检测的灵敏度为90.2%，特异度为99.2%，见表2。

表1　四种检测方法诊断肺癌的效果比较

表2　五种检测方法诊断胸腔积液的效果比较

五、肿瘤分期与DNA定量分析的相关性结果

根据TNM分期将所选病例中病理确诊及临床确诊肺恶性肿瘤患者进行分期，可以看出，早期肺癌(Ⅰ和Ⅱ)与晚期肺癌(Ⅲ和Ⅳ)在DNA异倍体的分布上无明显统计学差异(P>0.1)，见表3。

表3　肺癌分期与DNA定量分析的关系

讨论

正常人体细胞DNA含量多为二倍体细胞，DNA含量恒定，大约为7pg。而由致癌因素导致的基因丢失、突变、异常扩增或染色体移位、融合等被认为是肿瘤发生的早期分子事件，可导致细胞DNA含量的增加。因此，测定细胞DNA的含量，发现异常细胞，成为应用DNA异倍体进行肿瘤早期诊断的理论基础[9-11]。

一般认为，一旦检测到DI>2.5的异倍体细胞，或出现较多DI值为1.1～1.9的异倍体细胞，且聚集成峰，提示存在恶性瘤细胞。目前，DNA-ICM技术以其较高的敏感性和特异性已被用于包括宫颈在内的多种类型脱落细胞学标本的检测和恶性实体肿瘤恶性程度的评估。并已证实，DI和异倍体细胞数与细胞增殖、恶性程度及不良预后呈正相关[12-15]。

本研究采用麦克奥迪生产的MotiCytometer全自动细胞DNA 图像定量分析系统对280例肺部疾病患者的支气管镜刷检、活检组织(支气管镜活检、手术切除)标本进行细胞DNA含量检测，发现全自动细胞DNA定量分析技术与常规活检和常规支气管镜刷片检测之间无统计学差异。以活检和临床证实的肺癌诊断作为金标准，以活检为阳性值，计算活检的灵敏度为81.1%，特异度为100%；以DI≥1作为阳性界值计算全自动细胞DNA定量分析技术的的灵敏度为79.5%、特异度为85.4%；而在常规纤维支气管刷片中，以不典型细胞、癌疑细胞和癌细胞合计作为阳性细胞计算的常规纤维支气管镜刷片的灵敏度为75.4%、特异度为100%；血清CEA检测的灵敏度为56.6%，特异度为91.8%如表1。将DNA定量分析的结果分别与组织病理、细胞病理及血清CEA检测的结果进行对比，可以发现，DNA异倍体的检测与病理学(组织及细胞)检测无论是在敏感度、特异度，还是在阳/阴性预测值的结果上，其差异都是具有统计学意义的，而与血清CEA的检测结果无统计学差异。也就是说，DNA异倍体的检测的敏感性及特异性均不及病理学检测。

同样应用该DNA 图像定量分析系统对399例胸腔积液标本进行DNA含量测定，发现全自动细胞DNA定量分析在与组织学检测、传统细胞学检测及血清/胸水CEA等检测方法之间均无统计学差异(P>0.05)。以活检和临床证实的结果作为金标准，组织病理学的灵敏度为67.9%，特异度为100%；在胸水脱落细胞学检查中，以不典型细胞、癌疑细胞和癌细胞合计作为阳性细胞计算的脱落细胞学检查的灵敏度为83.6%，特异度为100%；以DI≥1作为阳性界值计算全自动细胞DNA定量分析技术的的灵敏度为62.1%、特异度为90.3%；血清CEA检测的灵敏度为75.7%，特异度为93.8%；胸水CEA检测的灵敏度为90.2%，特异度为99.2%如表2。将DNA异倍体检测结果分别与组织病理、细胞病理、胸水CEA及血清CEA检测结果进行比较，我们发现，DNA异倍体结果与细胞病理学及胸水CEA检测结果均具有统计学差异，无论是敏感性还是特异性均不及细胞病理及胸水CEA，而与血清CEA检测结果无统计学差异。在与组织病理学的比较中，可以看出，在敏感度及阴性预测值上，两者无统计学差异，而在特异度及阳性预测值方面具有统计学差异，出现这样的结果可能与阳性结果的样本量偏少有关。

对本组679例标本进行综合分析，根据TNM分期将所选病例中病理确诊及临床确诊肺恶性肿瘤患者进行分期，可以看出，早期肺癌(Ⅰ和Ⅱ)与晚期肺癌(Ⅲ和Ⅳ)在DNA异倍体的分布上无明显统计学差异(P>0.1)如表3，但随着肺癌的进展，DNA异倍体的检出率呈明显升高的趋势。由此推测，DNA异倍体的出现可能系肺癌发生的早期事件。

总之，全自动DNA定量分析技术是一种较敏感而特异的肺癌的筛查技术，与临床常用的血清CEA检测方法在结果上不具有统计学差异，虽然其灵敏度及特异度均较病理学检测结果偏低，但其方法简单，便于操作，风险小等优点亦可显著提高支气管镜刷检及肿瘤标志物CEA的阳性检出率。因而，检测DNA异倍体有望作为肺癌早期诊断与筛查的有价值的标志物。

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(本文编辑：黄红稷)

樊娜，张玉萍，孟夏，等. DNA异倍体检测在肺癌早期诊断中的价值[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(6)： 684-688.

【摘要】目的探讨DNA异倍体检测在肺癌筛查和早期诊断中的应用价值。方法对679例肺部疾病患者的支气管镜刷检、活检组织(支气管镜活检、手术切除)标本(280例)及胸腔积液脱落细胞399例经常规处理、HE染色，进行病理学检查，采用Motic全自动细胞DNA定量分析系统检测标本中的DNA异倍体，同时分别测定血清、胸腔积液中肿瘤标志物CEA含量。结果全自动细胞DNA定量分析与组织学检测、细胞学检测及血清癌胚抗原(CEA)检测结果之间比较无统计学差异(P>0.05)；DNA异倍体的检测结果与胸腔积液的病理学检测、脱落细胞学检测及血清/胸水CEA等检测结果之间亦无统计学差异(P>0.05)。其中，DNA异倍体检测灵敏度及特异度均略低于常规支气管刷片，而与血清CEA检测结果无差异；胸水中DNA异倍体检测的灵敏度与特异度亦均低于胸水脱落细胞学及胸水CEA检测，但与血清CEA检测结果无差异。同时，DNA异倍体在早期及晚期肺癌的检出结果中未见明显统计学差异(P>0.1)。结论全自动DNA定量分析技术是一种敏感而特异的肺癌的筛查技术；DNA异倍体可能属于肺癌发生的早期事件，检测DNA异倍体有望作为肺癌早期诊断与筛查的有价值的标志物；DNA异倍体与支气管镜刷检或与CEA联合检测可提高肺癌诊断的阳性率。

【关键词】支气管肺癌；胸腔积液；DNA异倍体；肿瘤标志物

value of DNA heteroploid in screening and early diagnosis of lung cancerFanNa,ZhangYuping,MengXia,DengWenjing,MingZongjuan,ShiJie,LiWei,ShiHongyang,WangWei,ZhongYujie,FangPing,YangShuanying.RespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004China

Correspondingauthor：YangShuanying,Email:yangshuanying66@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the value of DNA heteroploid in screening and early diagnosis of lung cancer. MethodsAll 280 biopsy samples and 399 exfoliocytology of pleural effusion samples were collected and underwent routine treatment, HE staining and pathological examination. Using Motic automatic cell DNA quantitative analysis system to detect DNA heteroploid in the samples. Meanwhile the carcino embryonie antigen(CEA) were measured both in serum and pleural effusion. ResultsThere was not a statistical significance in methodology between Motic automatic cell DNA quantitative analysis, cytology examination, histology examination and CEA measurement(P>0.05). The methodology of detecting DNA heteroploid in exfoliocytology, pathology and CEA measurement shows no statistical significance(P>0.05). The sensitivity and specificity of DNA heteroploiddetection was inferior compared with bronchial brushing, but no diffirence with the serum-CEA. The measurement of DNA heteroploid in pleural effusion has a lower sensitivity and specificity than exfoliocytology and pleural effusion-CEA, but no diffirence with serum-CEA. Meanwhile, there is no statistical significance of DNA heteroploid detection both in early stage and advanced stage of lung cancer. ConclusionsAutomatic cell DNA quantitative analysis can be a screening technology for lung cancer with high sensitivity and specificity. DNA heteroploid may occur in the early genesis of lung cancer and has a hope to become a biomarker for early diagnosis of lung cancer. The combination of DNA heteroploid, bronchial brushing and CEA can enhance the diagnosis rate of lung cancer.

【Key words】Lung cancer;Pleural effusion;DNA heteroploid;Tumor markers

(收稿日期：2015-11-06)

中图法分类号：R563

文献标识码：A

通讯作者：杨拴盈，Email: yangshuanying66@163.com

基金项目：西安交通大学医院第二附属医院科研基金资助[YJ(QN)201408]
作者单位： 710004 西安，西安交通大学第二附属医院呼吸内科

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.06.003