重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠神经功能及外周血CD34+细胞、脑组织MAP-2的影响

冯春国

(山东省垦利县人民医院 重症医学科, 山东 垦利, 257500)

重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠神经功能及外周血CD34+细胞、脑组织MAP-2的影响

冯春国

(山东省垦利县人民医院 重症医学科, 山东 垦利, 257500)

摘要:目的探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对脑出血大鼠神经功能外周血CD34+细胞及脑组织中组织微管相关蛋白-2(MAP-2)的影响。方法将36只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和rhG-CSF组。后2组采用注射自体不凝血法建立脑出血模型。术后rhG-CSF组皮下注射rhG-CSF 60 μg/(kg·d), 共8 d。模型组与假手术组皮下注射等量生理盐水, 1次/d, 共8 d。结果术后1 d, rhG-CSF组和模型组均有不同程度神经功能缺损，NSS评分无显著差别(P>0.05), rhG-CSF组术后4、8 d均较前一时间点显著改善(P<0.01), 且评分显著低于模型组(P<0.01), 显著高于假手术组(P<0.01)。术后4 d, rhG-CSF组与模型组动员的外周血CD34+含量显著升高(P<0.05或P<0.01), 术后8 d, rhG-CSF组与模型组大鼠外周血CD34+含量均均较术后4 d时显著下降(P<0.05); 术后4、8 d时组间比较，3组间均有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。术后8 d, 假手术组MAP-2蛋白表达量最高，模型组最低，rhG-CSF组显著高于模型组，但仍低于假手术组(P<0.05或P<0.01)。结论rhG-CSF可促进脑出血区神经元的增生和修复，增加外周血CD34+细胞含量，改善脑出血后神经功能。

关键词:重组人粒细胞集落刺激因子; 脑出血; 神经功能; CD34+细胞; 组织微管相关蛋白-2

脑出血是指非外伤性脑动脉、静脉及各毛细血管自发破裂引起的脑内出血，又称自发性脑出血，其发病率、致残率及死亡率高，临床发生率占全部脑卒中的35%[1]。传统治疗降低了脑出血病死率，而致残率却未得改善。目前，干细胞移植治疗坏死脑神经元，恢复损伤的神经元功能已取得一定疗效。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)可动员内源性骨髓基质干细胞(BMSC)释放至外周血中，介导受损神经细胞再生[2]。CD34抗原选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干细胞表面，增强造血干细胞的定植，促进造血干细胞的植入、造血功能恢复以及免疫功能重建。微管相关蛋白-2(MAP-2)是一种神经元骨架蛋白，参与神经元的生长和损伤后修复过程，是表达成熟的神经元标志物[3]。本研究主要观察了rhG-CSF对脑出血大鼠的神经功能、外周血CD34+细胞及脑组织MAP-2的影响，现报告如下。

1材料与方法

1.1　实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠36只，10～12周龄，体质量200～250 g, 由山东省实验动物中心提供，合格证号SCXK(鲁)20130004。

1.2　药物与试剂

rhG-CSF注射液购自山东齐鲁制药有限公司，国药准字S20063065。鼠源CD34单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。MAP-2多克隆抗体购自美国Sigma公司。SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3　方法

1.3.1分组、脑出血模型建立及给药方法: 36只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和rhG-CSF组，每组12只。以10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉。模型组和rhG-CSF组采用自体血注入法制备脑出血模型[4]。立体定向仪固定，头部正中纵形切口，暴露前囟和冠状缝，冠状缝前0.2 mm、中缝向右旁开0.4 cm处开颅骨至硬脑膜。取0.1 mL尾动脉血，将头皮针刺入脑内，进针深度为6 mm。将75 μL自体不凝血(肝素抗凝)缓慢注入基底节区，留针10 min后缓慢拔针。造模后根据Berderson等[5]方法进行模型评价，抗侧方推力减弱伴爬行时向对侧划圈，或意识丧失不能行走说明大鼠脑出血模型建立成功。术后1 h开始给药, rhG-CSF组皮下注射rhG-CSF 60 μg/(kg·d), 共8 d。模型组和假手术组皮下注射等量生理盐水, 1次/d，共8 d。

1.3.2神经行为学评价：以神经功能缺损评分(NSS)评价大鼠神经功能缺损情况: 0分，神经功能正常; 1分，轻度，即提尾时左前肢屈曲; 2分，中度，即行走时向左侧转圈; 3分，中度，向左侧倾斜; 4分，无自发行走，意识减退; 5分，与缺血有关的死亡。评分越高表明神经功能缺损越严重。

1.3.3外周血CD34+细胞含量检测：治疗第1、4、8天，麻醉大鼠，腹主动脉取血1 mL，使用溶血素裂解红细胞, 1 500转/min, 离心半径3.5 cm, 离心5 min后弃上清，加入PBS制成有核细胞悬液，使用CD34+单抗标记并用流式细胞仪进行计数。细胞含量用CD34+细胞占外周血白细胞百分比表示。

1.3.4MAP-2含量检测：采用免疫组织化学法检测，术后第8天，神经功能缺损评分及腹主动脉取血后，大鼠以4 ℃ 40 g/L多聚甲醛溶液经左心室至主动脉灌注，然后取距离前额2 mm至视交叉处部位剥取鼠脑，脱水，石蜡包埋。脑组织石蜡切片常规脱蜡水化。采用SABC法行免疫组化染色检测MAP-2阳性细胞。每例标本取4张片子，在400倍视野下每张片子上在出血病灶区随机取5个视野, Image-Pro Plus 5.0软件进行图像分析平均吸光度值。

1.4　观察指标

观察3组手术后1、4、8 d的NSS评分和外周血CD34+细胞含量，以及术后8 d各组MAP-2蛋白表达水平。

2结果

2.1　各组NSS评分比较

假手术组未出现神经功能缺损情况, rhG-CSF组和模型组均有不同程度神经功能缺损，表明脑出血模型建立成功。模型组术后各时间点评分无显著改善, rhG-CSF组术后4、8 d均较前一时间点显著改善(P<0.01)。术后1 d, rhG-CSF组和模型组评分无显著差别(P>0.05), 但均高于假手术组(P<0.01); 术后4 d和8 d时rhG-CSF组评分显著低于模型组(P<0.01), 显著高于假手术组(P<0.01)。见表1。

2.2　各组外周血CD34+细胞含量比较

术后1 d时，各组CD34+细胞含量无显著差异(P>0.05)。术后4 d时，假手术组无显著变化, rhG-CSF组与模型组动员的外周血CD34+含量显著升高(P<0.05或P<0.01); 术后8 d, rhG-CSF组与模型组大鼠外周血CD34+含量均较术后4 d时显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。术后4、8 d时组间比较, 3组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)。见表2。

分

与同时期假手术组比较, **P<0.01; 与同时期模型组比较, ##P<0.01; 与本组前一时刻比较, △△P<0.01。

表2　3 组大鼠术后外周血CD34+细胞含量　%

表2　3 组大鼠术后外周血CD34+细胞含量　%

组别例数术后1d术后4d术后8d假手术组120.16±0.050.15±0.070.15±0.06模型组120.16±0.040.29±0.16*△0.19±0.01*△rhG-CSF组120.15±0.060.58±0.16**##△△0.42±0.14**##△

与同时期假手术组比较, *P<0.05, **P<0.01; 与同时期模型组比较, ##P<0.01;

与本组前一时间点比较，△P<0.05, △△P<0.01。

2.3　各组MAP-2蛋白表达水平

术后8 d，假手术组免疫组化染色结果显示染色强，排列整齐均匀，形态规则。rhG-CSF组出血灶周边则染色均匀，形态较规则，突起排列呈束状，这意味着神经轴突和树突增生活跃。模型组出血灶周边有少量MAP-2表达，染色程度较低，排列稀疏。见图1。

A. 假手术组; B: rhG-CSF组; C. 模型组

图1神经元MAP-2免疫组化染色结果

假手术组、rhG-CSF组和模型组MAP-2蛋白表达量分别为(0.33±0.18)、(0.21±0.05)、(0.13±0.09)，两两比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

3讨论

脑出血可导致神经功能受损，如何减轻神经功能损伤，是目前脑出血研究的重点[6]。越来越多的证据[7]表明，高度分化的脑神经细胞是可再生的，脑出血可诱导内源性干细胞的增殖分化，但数量极少，自身修复能力有限。rhG-CSF可动员自身BMSC迁移到受损的脑组织区域，重塑受损神经元，是一种新兴干细胞移植疗法[8-9]。研究[10]显示大鼠皮下注射rhG-CSF动员BMSC, 可加速损伤血管段的内皮再生，动员BMSC归巢至脑缺血损伤区，免疫染色证实BMSC可分化成胶质细胞以及神经元细胞等, MRI检查可见病灶明显缩小。本研究用发现rhG-CSF组给药后NSS评分逐渐降低，且低于同时间点模型组(P<0.01), 表明rhG-CSF可有效改善脑出血大鼠神经功能。

CD34抗原选择性地表达于哺乳动物造血干细胞表面，是造血干细胞的表面标志，检测外周血CD34+细胞含量可反映外周血干细胞的含量[11-12]。Ponte[13]研究表明G-CSF可促进基质金属蛋白酶-2依赖性CD34+细胞的迁移。有研究表明急性脑缺血后神经功能的修复程度与外周血CD34+细胞的水平呈正相关[14]。本研究中，尽管rhG-CSF组术后8 d外周血CD34+细胞较术后4 d有所下降，提示rhG-CSF可有效促进CD34+细胞迁移，加快神经功能修复。

MAP-2是主要表达于神经元树突及胞体内微管，参与神经元的生长和修复过程，是成熟神经元的标志性蛋白。MAP-2在缺血中心几乎无丧失，而在完整的神经元和缺血半暗带则会表达升高。本研究免疫组化结果显示模型组MAP-2表达最低，rhG-CSF组出血灶周边则染色均匀，形态较规则，突起排列呈束状, MAP-2蛋白表达显著高于同时间点模型组，这意味着rhG-CSF可有效促进神经树突和胞体增生。

综上所述, hG-CSF治疗急性脑出血大鼠可动员BMSC归巢至出血部位，参与损伤脑缺血组织部位神经元修复及功能恢复，与夏明武等[15]报道基本一致，为临床应用hG-CSF治疗脑出血提供了依据。

参考文献

[1]Zhang LF, Yang J, Hong Z, et al. Proportion ofdifferent subtypes ofstroke in China[J]. Stroke, 2003, 34(9): 2091.

[2]戴杰, 陈蓝, 黄志东, 等. 骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑出血模型的实验研究[J]. 现代生物医学进展, 2011, 11(21):4030.

[3]Mondello S, Gabrielli A, Catani S, et al. Increased levels of serum MAP-2 at 6-months correlate with improved outcome in survivors of severe traumatic brain injury[J]. Brain Inj, 2012, 26(13-14): 1629.

[4]张昊, 马晓依, 吕妍, 等. 大鼠脑出血模型[J]. 中国医药指南, 2012, 10(34): 89.

[5]孙建军, 刘勇, 张蓬勃, 等. 大鼠脑出血后行为学改变和室管膜下区细胞增殖规律[J]. 中南大学学报: 医学版, 2009, 34(3): 236.

[6]Cao H, Ju K, Zhong L, et al. Efficacy of hyperbaric oxygen treatment for depression in the convalescent stage followingcerebral hemorrhage[J]. ExpTher Med, 2013, 5(6): 1609.

[7]Riquelme P A, Drapeau E, Doetsch F. Philos Trans R Soc Lond B[J]. Biol Sci, 2008, 363(1489): 123.

[8]Xia J, Luo M, Ni N, et al. Bone marrow mesenchymal stemcellsstimulate proliferation andneuronaldifferentiationof retinal progenitorcells[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e76157.

[9]谭位华, 张慧利. G-CSF对脑复苏的最新进展[J]. 江西医药, 2009, 14(11): 1145.

[10]吴俊, 陈绍良, 刘志忠, 等. 重组人粒细胞集落刺激因子修复大鼠动脉损伤[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(23): 4630.

[11]Clevers H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges[J]. Nature medicine, 2011, 17(3): 313.

[12]Anjos-Afonso F, Currie E, Palmer H G, et al. CD34-Cells at the apex of the human hematopoietic stem cell hierarchy have distinctive cellular and molecular signatures[J]. Cell Stem Cell, 2013, 13(2): 161.

[13]Ponte AL, Ribeiro-Fleury T, Chabot V, et al. Granulocyte-colony-stimulating factorstimulation of bone marrowmesenchymal stromal cellspromotes CD34+cell migration via a matrix metalloproteinase-2-dependent mechanism[J]. StemCellsDev, 2012, 21(17): 3162.

[14]Hirano K, Wagner K, Mark P, et al. Erythropoietin attenuates the sequels of ischaemic spinal cord injury with enhanced recruitment of CD34+cellsin mice[J]. J Cell Mol Med, 2012, 16(8): 1792.

[15]夏明武, 赵昊, 郭茜, 等. 重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠神经功能的影响[J]. 中华神经医学杂志, 2013, 12(9): 891.

Influence of rhG-CSF on the neurological function and peripheral blood CD34+cells and MAP-2 in brain tissues of rats with ICH

FENG Chunguo

(DepartmentofIntensiveMedicine,ThePeople′sHospitalofKenliCounty,Kenli,Shandong, 257500)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor (rhG-CSF) on the neurological function, peripheral blood CD34+cells and microtubule associated protein-2 (MAP-2) in brain tissues of rats with intracerebral hemorrhage (ICH). MethodsA total of 36 male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group, model group and rhG-CSF group. The model group and the rhG-CSF group were established by injecting autologous un-coagulated blood. After operation, subcutaneous injection of rhG-CSF 60 μg/(kg·d) was given to the rhG-CSF group for 8 days. The model group and the sham-operation group were injected subcutaneously with equivalent normal saline, 1 time per day for totally 8 days. ResultsOne day after operation, the rhG-CSF group and the model group had different degrees of neurological functional deficits, but neurological severity score(NSS) showed no significant difference (P>0.05). Four and eight days after operation, the neurological function significantly improved when compared with the previous time point in the rhG-CSF group (P<0.01), and NSS score in the rhG-CSF group was significantly lower than that in the model group (P<0.01), and was significantly higher than that in the sham-operation group (P<0.01). The peripheral blood CD34+cell level increased apparently 4 days after operation in the rhG-CSF group and the model group, and there was significant difference (P<0.05 or P<0.01). Eight days after operation, the peripheral blood CD34+cell level in the rhG-CSF group and the model group decreasedsignificantly when compared with that 4 days after operation(P<0.05).There were significant differences among three groups at each time point (P<0.05 or P<0.01). Eight days after operation, MAP-2 level was the highest in the sham-operation group and the lowest in the model group, which was still significantly lower in the model group and higher in the sham-operation group when compared with the rhG-CSF group (P<0.05 or P<0.01). ConclusionThe rhG-CSF can improve the hyperplasia and repair of neurons, increase peripheral blood CD34+cell level and improve the neurological function after hemorrhage in ICH.

KEYWORDS:recombinant human granulocyte-colony stimulating factor; intracerebral hemorrhage; neurological function; CD34+cells; microtubule associated protein-2

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11321453)

收稿日期:2014-12-09

中图分类号:R 722.15

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)07-025-04DOI: 10.7619/jcmp.201507006