血管平滑肌钠钙交换体研究进展

匡陈伟，郭瑞威，黄世亮，奚银燕，白 兰，乔 丹

钠钙交换体(sodium-calcium exchanger, NCX)在血管平滑肌细胞的生理及病理生理调节过程中充当着重要的离子调节作用， 目前研究认为其具有正向型和反向型两种状态。 反向型NCX 在高血压形成、血管平滑肌细胞病理性增殖及冠状动脉微循环障碍等病理过程中扮演着非常重要的角色。 相关研究发现，NCX 在参与调控血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）病理性增殖的过程中，与钙库操纵型钙离子通道（SOC）、肌浆网上钙泵（SERCA）等钙离子通道间存在紧密的交互对话现象。寻找到细胞内各离子通道间相互交互对话机制，并恰当地开发使用特异、高效的反向NCX 抑制剂，或可为临床治疗相关疾病带来突破性进展。

1 NCX概述

1.1 NCX 家族成员 到目前为止， 已发现并能实现克隆的NCX 成员有3 个大家族、9 个不同亚型[1]，它们是非K+依 赖 性 的NCX1、NCX2、NCX3；K+依 赖 性 的NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5； 阳离子依赖的NCKX6和NCLX。

1.2 血管平滑肌中NCX 的分子构成 血管平滑肌中NCX 主要亚型为NCX1 和NCX2， 此两种NCX 都来源于相同基因的可变剪接表达结果[2]。 而在血管平滑肌细胞的细胞核膜上，同样存在NCX 的亚型[3]，其具体亚型分布尚不清楚。

1.3 血管平滑肌细胞NCX 的转运特点 血管平滑肌上NCX 存在两种功能状态[4]，一是前向型，主要功能是按3Na+（in）∶1Ca2+（out）模式整合Na+内流与Ca2+外排；另一是反向型，主要功能是以1Na+（out）∶1Ca2+（in）模式转运上述离子，是一个生电的过程，该过程常导致细胞内Ca2+超载。

2 NCX的转型因素

2.1 膜电位及胞膜两侧的Na+、Ca2+浓度 王波等[5]发现，当细胞膜电位高于逆转电位时,NCX 处于正向模式,将Ca2+外排，反之NCX 反向模式激活，Ca2+向细胞内流动。

2.2 细胞氧供不足 缺氧等情况下， 肺动脉血管平滑肌细胞前向型NCX 功能受到抑制，导致其调节细胞内钙库释放Ca2+及细胞去极化过程中Ca2+浓度升高的能力下降[6]，此时反向型NCX 即被激活。

2.3 细胞培养基血清浓度变化 在使用原代培养的血管平滑肌细胞进行实验时，发现当培养基血清浓度由20%（80%DMEM+20%FBS）减低为10%（45%DMEM+45%Ham'sF12+10%FBS）后，NCX 由前向型转变为反向型，并伴随血管平滑肌细胞由分泌型转变为增殖型[7]。

3 反向NCX激活导致血管性高血压

3.1 参与内生哇巴因介导高血压 在肾源性高血压模型大鼠[8]和使用哇巴因诱导大鼠高血压的模型体内[9]，可见内生哇巴因浓度明显升高， 并伴随动脉平滑肌细胞上反向NCX1 等Ca2+通道蛋白表达增强[10]，诱导胞内钙超载并致使细胞处于高收缩状态，最终引发高血压[10]。 而在敲除NCX 基因及NCX1 表达缺陷的大鼠内，可见大鼠肠系膜动脉收缩性及血压将明显降低， 同时伴随着细胞膜上L 型Ca2+流的下降[11]。

3.2 参与肺动脉高压的形成 Zhang 等[12]研究先天性肺动脉高压患者时发现， 该类患者VSMC 中NCX1 处于反向型激活状态， 其介导的Ca2+内流导致肺动脉平滑肌细胞处于易收缩状态，并诱导肺动脉高压的病理表现。

3.3 参与盐敏感性高血压的形成 Iwamoto 等[13]发现，过表达NCX1.3 的大鼠对盐高度敏感，并伴随着胞内Ca2+浓度升高和细胞收缩性增强， 这种情况在NCX1 表达缺陷的转基因大鼠却刚好相反。 有研究使用KB-R7943 并无盐处理反应液时， 能抑制大鼠股动脉被藜芦碱诱导的强力收缩[14]。 猜想反向NCX1 是盐敏感性高血压病理过程中的重要的扳机性因子[15-16]。

4 NCX参与小动脉紧张性调节

经皮冠状动脉内介入治疗后期， 仍有超40%的患者存在长期的慢性心绞痛，反向NCX 介导的冠脉微循环障碍是重要的原因[17]。 细胞上自发性短暂外向电流(STOCs)对小动脉的紧张性有重要的调节作用，反向NCX 阻滞剂KB-R7943 能极强阻滞STOCs，并降低小动脉紧张性[18]。

5 参与血管平滑肌细胞增殖

5.1 与肺动脉平滑肌细胞增殖相关 血管平滑肌细胞中钙库的消耗常导致经反向NCX 内流的Ca2+流增加，去除细胞外Na+或使用特异性反向型NCX 抑制剂KB-R7943 处理人肺动脉平滑肌细胞后，能明显降低这一Ca2+流，且细胞增殖受到明显抑制[19]。

5.2 与主动脉平滑肌细胞增殖相关 使用基因干扰技术沉默大鼠Orai1 基因后， 平滑肌细胞中SOC 功能受到抑制， 并伴随NCX 及胞膜Ca2+通道的表达明显下降，细胞增殖受到抑制[20]，提示反向NCX 参与了SOC 调控的平滑肌细胞增殖效应。

5.3 与相关促增殖蛋白耦联 Syyong 等[21]发现，使用非选择性阳离子阻滞剂SKF-96365 或激活蛋白激酶C 都能抑制反向型NCX；Lemos 等[22]也发现，G 蛋白耦联受体激活过程中，反向NCX 参与了第二信使Ca2+流的转运，共同调节了HEK-293 细胞中TRPC3 的过表达。 此外，NCX与TRPC6 之间也存在着类似的功能相关联现象。

6 NCX与其他离子通道之间的相互作用与交互对话

6.1 与Orai1 之间通过交互对话共同参与VSMC 的增殖调控 Baryshnikov 等[20]发现，Orai1 和NCX1 在人类大动脉平滑肌细胞膜上交错成簇生长。 敲除Orai1 基因后，细胞膜上NCX1 的表达也明显下调， 并伴随细胞内自由Ca2+浓度明显下降，平滑肌细胞的增殖也明显受到抑制，考虑SOC 离子通道被抑制后抑制了NCX1。

6.2 与TRPC6 之间的交互对话 在使用哇巴因诱导大鼠高血压的模型中[9]，除NCX1 表达量明显上升外，TRPC6表达也明显上升；而当NCX1 基因被沉默后，TRPC6 的功能丧失，且表达量也下降近1/3；而使用基因沉默技术沉默TRPC6 后，NCX1 对哇巴因不再具有反应。 提示NCX1 与TRPC6 之间存在紧密信号通路。

6.3 与SOC 之间的交互对话 Guo 等[7]发现，原代培养的血管平滑肌细胞经诱导表型转换后，伴随着SOC 构成分子表达的增强，NCX1 分子表达也显著上调。 用KB-R7943 预处理VSMC 后， 用毒胡萝卜素激活SOC 并补充细胞培养基中Ca2+，胞膜上的钙内流峰值显著降低，这表明胞膜上钙内流不仅仅由SOC 介导，NCX1 可能也参与其中， 并推测在表型转换的VSMC 上，SOC 可能与NCX 间存在着交互对话， 通过影响胞内Ca2+浓度调控VSMC 的 增殖[23]。

6.4 与肌浆网钙泵（SERA)之间的交互对话 Davis[24]、Akolkar 等[25]在使用猪的冠状动脉实验时发现，使用Ca2+螯合剂BAPTA 后，NCX1 摄取放射性45Ca2+量明显增加；相同情况下， 单使用毒胡萝卜素抑制SERA 功能后NCX1 摄取量下降。 而在既使用Ca2+螯合剂装载细胞，又加入毒胡萝卜素时，NCX1 摄取放射性45Ca2+量没有被抑制，这提示SERA 与NCX1 之间通过信号的相互交流，共同参与调节肌浆网钙库的钙储备功能。

6.5 与Na+-K+泵第二亚型alpha2 之间的交互对话Matchkov 等[25-27]在小动脉上进行试验时发现，伴随Na+-K+泵第二亚型alpha2 的下调，NCX 的表达量也出现了明显的下降。 当alpha2 表达下降时，NCX 对毒毛旋花苷的敏感性也随之下降， 并证实NCX 与alpha2 及耦联素蛋白connexin43 之间存在相互关联， 共同参与了血管壁紧张性的调节。

6.6 与相关蛋白耦联受体之间的对话 NCX1 在参与细胞离子稳态与浓度调节时，能被某些组织自身所表达的磷酸受纳蛋白（PLM）所抑制[28]，从而间接参与调节细胞内离子浓度。 除此之外， 在血管平滑肌细胞内的某一特定区域中，NCX 还通过与Na+-K+泵之间相互信号作用，调控着血管平滑肌细胞之间的相互交流[29]。

7 NCX抑制剂研究进展

7.1 KB-R7943 Iwamoto 等[30]在1996 年发现并报道KB-R7943，该阻滞剂在微摩尔浓度水平便可特异性地阻断NCX 的反向转运模式。 目前KB-R7943 已广泛在实验中使用，其特异性阻断反向NCX 的功能有待进一步开发与研究。

7.2 SEA0400 SEA0400 是拥有更高选择性的NCX 抑制剂[31]。 在盐潴留依赖高血压大鼠模型，在使用SEA0400后[13]，股动脉血流升高，外围动脉血管舒张。

7.3 SN-6 Inoue 等[32]于2002 合 成 并 报 道 了SN-6，该试剂对反向NCX 的抑制效应类似于KB-R7943， 但其对反向NCX 的选择性高于KB-R7943。N-6 主要作用于反向NCX 的Val227、Tyr228 等位点，与K229Q 及F223E 位点结合可使I1 失活。

8 结语

血管平滑肌细胞中NCX 其自身或与其他离子通道之间通过交互对话机制， 共同参与心血管系统相关疾病的形成。 研究NCX 意义主要是：（1）NCX 在血管平滑肌病理性增殖等病理过程中充当重要离子转运角色，其功能研究成果将为心脑血管等疾病的治疗带来重要的理论基础，为临床药物的开发提供依据。 （2）NCX 与其他离子通道之间的交互对话机制一旦明确， 便可找到相关疾病的离子通道变化规律，有针对性地开发治疗药物。（3）对于以NCX 激活造成的相关疾病来说， 特异性NCX 阻滞剂的开发将使治疗变得高效和简洁。

[1] Lytton J. Na+/Ca2+exchangers： three mammalian gene families control Ca2+transport[J]. The Biochemical Journal, 2007,406(3)：365-382.

[2] Nakasaki Y, Iwamoto T, Hanada H, et al. Cloning of the rat aortic smooth muscle Na+/Ca2+exchanger and tissue-specific expression of isoforms [J]. Journal of Biochemistry, 1993,114(4)：528-534.

[3] Xie X, Wu G, Lu ZH, et al. Presence of sodium-calcium exchanger/GM1 complex in the nuclear envelope of non-neural cells： nature of exchanger-GM1 interaction [J]. Neurochemical Research, 2004,29(11)：2135-2146.

[4] Zhang YH, Hancox JC. Regulation of cardiac Na+-Ca2+exchanger activity by protein kinase phosphorylation-still a paradox[J]?Cell Calcium, 2009,45(1)：1-10.

[5] 王波. 乳酸代谢抑制对大鼠心肌钠钙交换体调节作用的研究[D].西安：陕西师范大学， 2006.

[6] Zheng YM, Wang YX. Sodium-calcium exchanger in pulmonary artery smooth muscle cells[J]. Annals of The New York Academy of Sciences, 2007,1099：427-435.

[7] Guo RW, Yang LX, Li MQ, et al. Stim1- and Orai1-mediated store-operated calcium entry is critical for angiotensin Ⅱ-induced vascular smooth muscle cell proliferation [J].Cardiovascular Research, 2012,93(2)：360-370.

[8] Linde CI, Karashima E, Raina H, et al. Increased arterial smooth muscle Ca2+signaling, vasoconstriction, and myogenic reactivity in Milan hypertensive rats [J]. American Journal of Physiology Heart And Circulatory Physiology, 2012,302(3)：H611-620.

[9] Pulina MV, Zulian A, Berra-Romani R, et al. Upregulation of Na+and Ca2+transporters in arterial smooth muscle from ouabain-induced hypertensive rats[J]. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 2010,298(1)：H263-274.

[10] Linde CI, Antos LK, Golovina VA, et al. Nanomolar ouabain increases NCX1 expression and enhances Ca2+signaling in human arterial myocytes： a mechanism that links salt to increased vascular resistance [J]? American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 2012,303(7)：H784-794.

[11] Zhang J, Ren C, Chen L, et al. Knockout of Na+/Ca2+exchanger in smooth muscle attenuates vasoconstriction and L-type Ca2+channel current and lowers blood pressure [J]. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 2010,298(5)：H1472-1483.

[12] Zhang S, Dong H, Rubin LJ, et al. Upregulation of Na+/Ca2+exchanger contributes to the enhanced Ca2+entry in pulmonary artery smooth muscle cells from patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension [J]. American Journal of Physiology Cell Physiology, 2007,292(6)：C2297-2305.

[13] Iwamoto T, Kita S, Zhang J, et al. Salt-sensitive hypertension is triggered by Ca2+entry via Na+/Ca2+exchanger type-1 in vascular smooth muscle [J]. Nature Medicine, 2004,10 (11)：1193-1209.

[14] Bocquet A, Sablayrolles S, Vacher B, et al. F 15845, a new blocker of the persistent sodium current prevents consequences of hypoxia in rat femoral artery [J]. British Journal of Pharmacology, 2010,161(2)：405-415.

[15] Iwamoto T, Kita S. Topics on the Na+/Ca2+exchanger： role of vascular NCX1 in salt-dependent hypertension [J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2006,102(1)：32-36.

[16] Iwamoto T, Kita S. Hypertension, Na+/Ca2+exchanger, and Na+,K+-ATPase[J]. Kidney International, 2006,69(12)：2148-2154.

[17] Jacobshagen C, Maier LS. Pathophysiology of chronic myocardial ischemia[J]. Herz, 2013,38(4)：329-333.

[18] Cai F, Li PY, Yang Y, et al. Characteristic of spontaneous transient outward potassium currents in vascular smooth muscle cells of porcine coronary artery [J]. Acta Physiologica Sinica,2007,59(1)：27-34.

[19] Zhang S, Yuan JX, Barrett KE, et al. Role of Na+/Ca2+exchange in regulating cytosolic Ca2+in cultured human pulmonary artery smooth muscle cells [J]. American Journal of Physiology Cell Physiology, 2005,288(2)：C245-252.

[20] Baryshnikov SG, Pulina MV, Zulian A, et al. Orai1, a critical component of store-operated Ca2+entry, is functionally associated with Na+/Ca2+exchanger and plasma membrane Ca2+pump in proliferating human arterial myocytes [J]. American Journal of Physiology Cell Physiology, 2009,297(5)：C1103-1112.

[21] Syyong HT, Poburko D, Fameli N, et al. ATP promotes NCXreversal in aortic smooth muscle cells by DAG-activated Na+entry[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,357(4)：1177-1182.

[22] Lemos VS, Poburko D, Liao CH, et al. Na+entry via TRPC6 causes Ca2+entry via NCX reversal in ATP stimulated smooth muscle cells [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007,352(1)：130-134.

[23] Breukels V, Touw WG, Vuister GW. Structural and dynamic aspects of Ca2+and Mg2+binding of the regulatory domains of the Na+/Ca2+exchanger [J]. Biochemical Society Transactions,2012,40(2)：409-414.

[24] Davis KA, Samson SE, Hammel KE, et al. Functional linkage of Na+-Ca2+-exchanger to sarco/endoplasmic reticulum Ca2+pump in coronary artery： comparison of smooth muscle and endothelial cells[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2009,13( 8b)：1775-1783.

[25] Akolkar G, Pande J, Samson SE, et al. Thapsigargin decreases the Na+-Ca2+exchanger mediated Ca2+entry in pig coronary artery smooth muscle [J]. Biochimica Et Biophysica Acta,2012,1818(3)：730-737.

[26] Lynch RM, Weber CS, Nullmeyer KD, et al. Clearance of store-released Ca2+by the Na+-Ca2+exchanger is diminished in aortic smooth muscle from Na+-K+-ATPase alpha 2-isoform gene-ablated mice[J]. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 2008,294(3)：H1407-1416.

[27] Matchkov VV, Moeller-Nielsen N, Dam VS, et al. The alpha2 isoform of the Na+,K+-pump is important for intercellular communication, agonist-induced contraction, and EDHF-like response in rat mesenteric arteries [J]. American Journal of Physiology Heart And Circulatory Physiology, 2012,303 (1)：H36-46.

[28] Ahlers BA, Zhang XQ, Moorman JR, et al. Identification of an endogenous inhibitor of the cardiac Na+/Ca2+exchanger,phospholemman [J]. The Journal of Biological Chemistry,2005,280(20)：19875-19882.

[29] Matchkov VV, Gustafsson H, Rahman A, et al. Interaction between Na+/K+-pump and Na+/Ca2+-exchanger modulates intercellular communication[J]. Circulation Research, 2007,100(7)：1026-1035.

[30] Iwamoto T, Watano T, Shigekawa M. A novel isothiourea derivative selectively inhibits the reverse mode of Na+/Ca2+exchange in cells expressing NCX1[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1996,271(37)：22391-22407.

[31] Iwamoto T, Kita S, Uehara A, et al. Molecular determinants of Na+/Ca2+exchange (NCX1) inhibition by SEA0400 [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004,279(9)：7544-7553.

[32] Inoue Y, Ito K, Sakaue T, et al. Characterization of SN-6, a novel exchange inhibitor and its renal protective effect [J].Clinical Calcium, 2004,14(8)：84-91.