结直肠癌体外药敏与多药耐药基因表达的相关性研究进展

刘亿综述，徐亮审校

（泸州医学院附属医院胃肠外科，四川泸州646000）

结直肠癌体外药敏与多药耐药基因表达的相关性研究进展

刘亿综述，徐亮审校

（泸州医学院附属医院胃肠外科，四川泸州646000）

大肠癌是我国最常见的消化系恶性肿瘤之一，发病率逐年增加，病死率居高不下。手术是重要的治疗方法，然而单纯手术的疗效相当有限。化疗占据越来越重要的地位，但是目前疗效仍不理想，其主要原因是存在肿瘤的多药耐药性（multidrug resistance，MDR）。肿瘤是一个异质性、多态性、分化不均的细胞群体，同一组织类型的肿瘤对同一药物的敏感性存在着差异，肿瘤化疗效果会受到严重影响。因此，为了提高化疗效果和避免多药耐药的产生，实现对患者的个体化治疗，个体肿瘤药敏试验显得越来越来重要。本文就肿瘤体外药敏试验与多药耐药基因表达的相关性研究进展做一综述。

1 恶性肿瘤体外药敏试验研究进展

1.1 体外药敏试验的概述

体外药敏试验是在实验室条件下检测肿瘤标本对选择性给予的化疗药物的药物反应，通常以肿瘤的生存是否受到抑制作为衡量敏感或者耐药的标准[1]。一个理想的体外药敏检测方法应该具备以下特点：①所需肿瘤组织少；②标本可评价率高；③结果具有较好的重复性；④体外试验结果与体内治疗反应一致性高；⑤操作流程标准化和评价标准规范化，结果判定可靠、客观；⑥具备产业化条件[2]。1953年Black和Gree LA首先报道了癌标本的体外药敏试验[3]。而后伴随着肿瘤化疗药物的不断增加及肿瘤化疗的不断发展，肿瘤体外药敏试验随之发展起来。

1.2 体外药敏试验的常用方法

上世纪70年代后期Salmon和Hamburger首先建立了适宜人肿瘤原代细胞生长的双层软琼脂培养系统，既肿瘤干细胞克隆分析（human tumor cloning assay，HTCA），为抗癌药物敏感试验的发展打下了基础。1983年Mosmann[4]首创四氮唑盐比色法（MTT法），这种方法最初用于研究IL-22等细胞因子对鼠淋巴瘤细胞系存活和增殖作用的影响，近年来MTT法因其简单、快速、灵敏等特点被广泛用于临床。20世纪70年代报道了三磷酸腺苷生物荧光法（ATP-TCA），该技术的基本原理是荧光酶在有氧条件下，可以和荧光素结合后催化三磷酸腺苷（ATP）转变成AMP（磷酸腺苷），同时释放出荧光（波长562 nm），所释放的荧光强度与ATP含量呈正相关[5]。上世纪80年代，还产生了较多的检测方法包括：胸腺嘧啶掺入法（H3-t）、细胞毒差别染色检测法（DISC）、流式细胞仪法（FCM）等，它们统称为单层细胞培养法，这种方法虽然有简单实用、适用肿瘤类型广、可体外大量扩增等优势，但是它破坏了肿瘤细胞体内生长的环境，导致结果与临床实际存在一定差别。90年代以来，更多研究者开始努力寻找一种培养肿瘤的环境，这种环境能真实反映体内肿瘤生长情况。于是单层细胞培养的药敏试验开始向三维培养发展。80年代末Hoffman创立了三维立体组织培养法（HDRA法），这种方法将新鲜的肿瘤标本制成约含100～200个细胞、大小约1～2 mm3的微小团块，加入有助于贴壁的基质和无血清复合培养基，培养24 h后加抗癌药继续培养72 h染色记数[6-7]。这些药敏检测方法都有各自的优缺点，目前还没有一个完全理想的方法，能真正实现体内外完全一致。

2 结直肠癌多药耐药基因研究进展

目前化疗在结直肠癌中的地位越来越明显，但是化疗效果一直不明显，一个主要原因是多药耐药（MDR），多药耐药现象是指肿瘤细胞一旦对一种化疗药物产生耐药性，对其他结构和功能不同的化疗药物也产生交叉耐药。目前研究认为[8]多药耐药主要有几种机制：①耐药相关蛋白异常表达；②MDR酶活性改变；③凋亡抑制；④转录因子的激活等。

2.1 耐药相关蛋白的异常表达

P-糖蛋白（P-gp）目前P-糖蛋白在多药耐药研究中最为重要、研究最为深入。P-gp也称P170糖蛋白，因为它的相对分子质量为170×103，它是1976年Juliano和Ling在研究对秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary，CHO）时发现[9]。P-gp由1280个氨基酸组成，是一种ATP依赖跨膜糖蛋白，由MDR1（multidrug resistance1）基因编码表达。目前研究认为[10]，p-gp耐药的机制主要是它的药物泵作用，通过这个泵将多种药物泵出细胞外，使胞内药物减少。MDR1mRNA在机体很多组织中均有表达，但是MDR表型的肿瘤细胞中，MDR1/P-gp存在过度表达，并且大肠癌是表达水平及频率最高的肿瘤之一[11]。Emdad等[12]利用腺病毒将黑色素瘤分化相关基因-7转入p-gp介导的人结直肠癌多药耐药细胞株SW620/Dox后，大大提高了对化疗药物的敏感性。

多药耐药相关蛋白（MRP）研究最多的是MRP1，它也是一种ATP依赖的MDR相关的药物泵，是继P-gp之后发现的第2个ABC跨膜转运蛋白超家族成员，相对分子质量190 kD，又称ABCC1，在20世纪90年代由Cole等在研究阿霉素耐药的小细胞肺癌细胞时发现的。MRP1与p-gp在结构和功能上有许多相似，主要分布于细胞膜，定位于高尔基体、细胞囊泡等处。与p-gp介导的MDR的主要不同在于耐药谱差异，常合并有谷胱甘肽（GSH）活性升高，它能识别和转运与GST耦合的底物，故又称为GSH-X泵[13]。

除此之外，目前研究的较多的还有乳腺癌耐药相关蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP）/ABCG2及肺耐药相关蛋白（lung resistance protein,LRP)等。

2.2 MDR酶活性的改变

谷胱甘肽-S-转移酶谷胱甘肽-S转移酶（glutathione S transferases，GST）是一个同源二聚体酶的超基因家族，普遍存在于各种生物体内。目前为止，已经发现了α、π、θ、μ和ζ5个亚型，其中存在于细胞质中的有α、μ、π、θ四个亚型[14]。其中GST-π在肿瘤细胞系中分布最广，约占据90%，它在人类多种肿瘤组织中均有高表达，与结直肠癌关系非常密切[15]。GST-π为一组二聚体蛋白质，是一种关键酶，它主要存在于细胞液中，能在谷胱甘肽结合反应中催化该反应的启动，药物产生的过氧化物可被它还原为无毒物质。特别是某些抗癌药物与GSH结合，增加其水溶性，加速其通过尿液与胆汁排泄，从而使体内细胞药物浓度下降而降低药物的疗效，最终使该类化疗药物产生耐药。沈金辉等[16]利用免疫组织化学S-P法研究发现，在结肠癌组织中GST-π的表达明显高于结肠正常组织，可见，GST-π可以协助结直肠癌的诊断。

拓扑异构酶研究发现Topo有2种类型TopoⅠ和TopoⅡ，其中TopoⅡ参与真核细胞DNA的复制、转录和染色体分离等过程，能促进肿瘤细胞内DNA合成、提高肿瘤的增殖能力[17]。因此，结直肠癌的多药耐药与TopoⅡ活性的降低或者其含量的减少有直接关系。

3 临床意义

经过一系列的研究，对恶性肿瘤体外药敏试验研究进展，以及对结直肠癌多药耐药机制有了初步了解，目前国内外正在对二者之间的相关性作进一步研究。袁庶强等[18]利用逆转录聚合酶联反应和免疫组织化学法测定结直肠癌组织中MDR1、MRP1、ABCG2基因蛋白表达水平，发现基因和蛋白的表达无相关性，同时利用三维培养体外药敏试验检测表阿霉素、顺铂、草酸铂、5-FU、泰帝素、伊立替康6种単药和5-FU+表阿霉素、5-FU+伊立替康、5-FU+草酸铂、5-FU+泰帝素+顺铂4组联合用药的抑制率和敏感性，结果发现，単药组中抑制率和敏感性最高者均为5-FU，联合用药中5-FU+奥沙利铂最高，同时发现，MDR1、MRP1、ABCG2蛋白高表达与肿瘤对表阿霉素耐药有相关性。韩杰等[19]利用MTT法对胃癌、大肠癌行体外药敏测定，并利用免疫组织化学法初步探测了耐药基因与药敏之间的相关性。经过研究它们的相关性，这对手术患者术后化疗确实有很好的指导作用。然而，对不需或不愿手术的患者进行耐药蛋白的检测，是否可以直接通过外周血液进一步检测耐药基因蛋白，侍作亮等[20]利用荧光定量聚合聚合酶联反应（FQ-PCR）法检测原发性肝癌外周血有核细胞与术后肿瘤标本中MDR1基因的表达，发现外周血MDR1基因表达的结果与肝癌细胞MDR1的表达明显相关，即可以通过外周血行肝癌耐药基因的检测，那么我们也可以用同样的方法检测结直肠癌的耐药基因。

4 问题与展望

结直肠癌的异质性、多态性及分化不均等导致了MDR机制的复杂性，呈现出多机制、多因素的特点，特别是MDR与化疗药物之间深层次的联系更加复杂。通过研究，它有利于我们进一步明确结直肠癌多药耐药机制以及与肿瘤药敏之间的关系，指导临床医生了解肿瘤患者耐药基因的表达情况，可以预测肿瘤对化疗的反应程度，制定合理的化疗方案，真正实现个体化治疗。然而，目前对结直肠癌多药耐药的研究只是冰山一角，还需要进一步研究，特别是多药耐药基因蛋白的分子机制及内在联系；另一方面，我们可以进一步研发更先进的药敏检测技术，真正实现体内外药敏的一致性。

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（2014-11-26收稿）

作者投稿系统http∶//xb.lzmc.edu.cn/

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A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.031

刘亿（1986-），男，硕士生，E-mail：516155767@qq.com