ELISA技术在食品安全检测中的应用研究进展

张强 （安徽科技学院生命科学学院，安徽 蚌埠233100）

食品安全问题不仅会影响广大人民群众的身体健康和生命安全，而且还制约着整个国家的经济发展。然而，当下的食品安全问题形势严峻，问题频发，三聚氰胺、苏丹红、致癌毒米、阜阳大头娃娃奶粉以及瘦肉精等数十起食品安全事件被曝光后，引起了人们的极大关注［1］。目前，应用于食品安全检测的技术有仪器检测法、化学分析检测法、免疫分析检测法、定性、定量、在线监测检测法等［2］。酶联免疫吸附测定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）作为一种免疫分析检测方法，具有操作简便、有效、特异性强、灵敏度高、不需要昂贵的仪器设备等优点，已经广泛应用于药物残留、重金属污染、生物毒素、食品添加剂检测等诸多方面［3，4］。笔者对ELISA技术在食品安全检测中的应用进行了综述，并就其在应用中存在的不足及发展趋势和应用前景进行了探讨，旨在进一步促进该技术在食品安全检测领域的应用和推广。

1 ELISA技术简介

ELISA技术是一种将抗原、抗体免疫反应的特异性与酶催化作用的高效性有机地结合起来的一种非放射性应用型检测方法。ELISA技术的基础是抗原或抗体的固相化及抗体或抗原的酶标记，其基本原理包括：抗体 （抗原）吸附在固相载体的外表面，并维持抗体 （抗原）的免疫活性；抗体 （抗原）能通过共价键来与酶连接而形成酶复合物，并维持原有的免疫学和酶学活性；酶复合物与对应的抗体 （抗原）结合后，可根据加入底物后的颜色改变来判定试验结果［5］。

ELISA技术可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在测定过程中有3个必要的试剂，即固相的抗原或抗体 （免疫吸附剂）、酶标记的抗原或抗体 （结合物）和酶反应的底物。根据这些试剂结合方式的不同，ELISA技术主要分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法等几种不同应用类型［6］。

2 ELISA在食品安全性检测中的应用

2.1 生物毒素检测

生物毒素也称为天然毒素，是生物体分泌代谢或半生物合成产生的、不可自复制的有毒化学物质。目前，已发现的的生物毒素有数千种，依据来源可以把生物毒素分为微生物毒素、植物毒素和动物毒素［7］。存在于食物中的毒素往往会引起食物中毒、胃肠炎、溶血性贫血甚至癌症等威胁人类健康的疾病，其在食品中的含量在每个国家都具有严格控制标准［8］。黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素中毒性最强、危害最大的一种［9］。刘蓉等［10］利用基因工程手段制备了黄曲霉毒素B1的单链抗体，将其用于ELISA检测方法以检测酱油中黄曲霉毒素B1的含量，其检测限为0.10ng／mL，平均加标回收率在84%～109%之间；肖智等［11］将黄曲霉毒素B1转化为半缩醛B2a，再以B2a为半抗原通过杂交瘤技术制备了黄曲霉毒素B1高特异性单克隆抗体，通过ELISA技术对黄曲霉毒素B1的检测限为 （0.6±0.078）ng／mL，抗体与其他黄曲霉毒素的交叉反应率显著降低；Wang等［12］建立了基于多克隆抗体检测黄曲霉毒素M1的ELISA快速分析方法，该法检测限为1.0ng／mL。目前，ELISA技术除了应用于食品中黄曲霉毒素的检测外，还在脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （DON）、赤霉烯酮 （ZEN）等其他真菌毒素［13］及河豚毒素、蓖麻毒素和苦马豆素等动物和植物源毒素［14］检测方面得到了广泛的应用，并均取得了较理想的效果，表明该法在食品毒素检测方面大有潜力可挖，值得进一步应用。

2.2 致病微生物检测

病原微生物可引起食源性疾病，是食品生物性污染的重要因素，也是影响食品安全的主要因素之一。传统的病原微生物学检查以染色、培养、生化鉴定等为主，将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法［15］。这些常规方法需要大量的手工劳动，检验周期长，对特征菌落的判定受主观因素影响较大，容易漏检，无法满足现代对微生物快速检测的需要，而ELISA技术在这方面具有一定优势。目前，已有许多研究者借助ELISA技术建立了食品中有害菌的检测方法。李建科等［16］建立了果汁中耐热菌的间接性ELISA检测方法，检测限为5×104CFU／mL，检测时间比目前国内外普遍采用的美国库克食品实验室检测法缩短3～4d；张显昱等［17］建立了能够快速检测样品中鮰爱德华菌的竞争性ELISA检测方法，该方法对鮰爱德华菌的最低检测量为1×106cells／mL，具有良好的灵敏性和特异性；伍燕华等［18］建立了快速检测食品中沙门氏菌的双抗夹心ELISA方法，该法最低检测量为1×104CFU／mL，与其他杂菌不存在交叉反应，可以快速、准确地检测食品中的沙门氏菌。目前，ELISA法可用于检测食品中单核细胞增生李斯特菌、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、军团菌、假单胞菌属、大肠杆菌O－157、致贺氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和腊样芽抱杆菌等多种致病微生物，在病原微生物检测方面具有很大的发展空间。

2.3 重金属污染检测

随着环境污染的日益加剧，食品原料或成品的重金属污染也日趋严重，如何快速、有效地检测出受重金属污染的食品迫在眉捷。传统的重金属检测方法有原子吸收光谱法、X射线荧光光谱法、电感耦合等离子发射光谱法 （ICP－AES）等，该类方法准确、敏感，但仪器较昂贵，操作复杂，需要专业的工作人员，不适于大规模快速普查。近年来，ELISA技术在食品中重金属检测方面得到了迅速发展。郭常伟等［19］建立了样品中铜离子的间接竞争性ELISA检测方法。该法最低检测限为2.0ng／mL，与ICPAES法检测结果的总符合率超过94%；方淑兵等［20］建立了重金属汞离子的间接竞争性ELISA分析方法，该法检测限为0.45μg／L，灵敏度为4.10μg／L，与其他金属均无明显交叉反应，与电感耦合等离子体质谱 （ICP－MS）法检测结果具有很好的相关性 （相关系数为0.988）；杨依锦等［21］建立了重金属铅的间接竞争性ELISA检测方法，最低检出限为0.32ng／mL，与ICP－MS法检测结果的总符合率超97%；王津等［22］建立了样品中镉离子的间接竞争性ELISA检测法，其检测限为0.76μg／L，与其他金属螯合物的交叉反应率均低于1.32%。上述研究结果表明，ELISA法具有较高的准确性，适用于样品中重金属的快速筛选和检测。

2.4 农药残留检测

自1983年以来，ELISA技术已成为国际上分析农药残留的首选方法，目前已广泛用于有机磷类、有机氯类、除虫菊酯、磺胺类等农药残留的检测［23］。方松等［24］建立了基于多克隆抗体的氯噻啉间接竞争酶性ELISA分析方法，该方法的最低检测限为1.8μg／L，所得多克隆抗体除与吡虫啉有较大的交叉反应外，与其他结构相似的化合物无明显交叉反应；余鹏敏等［25］建立了样品中乙草胺含量的间接竞争性ELISA检测法，该方法灵敏度高、特异性强，检测限为24.4μg／L，与结构相似的其他农药无明显交叉反应，适合环境和农产品中乙草胺的检测；韦倩妮等［26］建立了有机磷农药三唑磷的间接性ELISA检测法，该方法最低检测限为1.0μg／L，定量检测线性范围为2.5～100.0μg／L，具有高度的特异性，与其他有机磷农药结构类似物无明显交叉反应。目前，许多国家已开发出相应的ELISA检测试剂盒，可用于直接检测果蔬等植物性食品中的农药残留。

2.5 兽药残留检测

食品中兽药残留是影响世界各国食品安全的主要因素。食品中兽药残留主要包括抗生素类、激素药类、抗球虫类、呋喃药类、磺胺药类和驱虫药类药物。目前，关于动物性食品兽药残留检测中ELISA法的应用已取得显著成效。杨君宏等［27］建立了一种检测牛组织中阿维菌素类药物 （Avermectins，AVMs）残留的间接竞争性ELISA方法，该法可同时检测牛肝脏和肌肉中阿维菌素、伊维菌素和埃普里诺菌素残留，检测限为1.1ng／mL；姜金庆等［28］建立了样品中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争性ELISA检测方法，检测限为0.1ng／mL，该法对恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星均能特异性识别；王鹤佳等［29］建立鸡肉中尼卡巴嗪残留的竞争性ELISA检测方法，在鸡肉中检测限为9.2μg／kg，在精密度、灵敏度和准确度方面均能满足兽药残留筛选检测要求。上述研究结果表明，随着ELISA技术的不断完善和发展，其在动物性食品中兽药残留检测方面的应用前景将十分广阔。

2.6 转基因食品的检测

随着转基因产品种类和数量的不断增多，转基因生物及其产品的安全性也越来越受到人们关注，越来越多的国家要求对转基因产品实行标签制度，这就对转基因食品的检测提出了更高的要求。目前，ELISA技术已广泛应用于转基因食品的检测。顾炜炜等［30］研制了用于检测转Btcry2Ab／2Ac杀虫蛋白基因食品的直接竞争性ELISA试剂盒，最低检测限为40ng／mL，可用于转基因食品的快速、批量检测；朱振营等［31］建立了转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白的夹心ELISA检测方法，检测限为0.25×10－3g／L；刘志浩等［32］建立了检测转膦丝菌素乙酰转移酶基因玉米的双抗体夹心ELISA检测方法，并与传统的聚合酶链式反应 （PCR）检测法进行比较，2种检测方法的符合率为100%，确定了该方法的准确性和可靠性；Guerler等［33］建立了转CryAb蛋白基因食品的双抗体夹心ELISA检测法，对CrylAb蛋白的分析检测限为0.4ng／mL，检测特异性优于实时荧光PCR，证实了ELISA技术在转基因食品的检测中具有可利用性。

2.7 过敏原的检测

食品的过敏反应已成为人类生活中普遍存在的一个严重问题，引起了人们的广泛关注。建立有效的食品过敏原检测方法是过敏原安全管理的技术保障。目前ELISA技术是除PCR反应以外的另一种非常重要的检测方法。张洁琼等［34］建立了杏仁过敏原苦杏仁球蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，该法对甜杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限为 （6.36±1.02）μg／L，与常见的14种植物性蛋白没有交叉反应；谈超等［35］建立了绿豆过敏原蛋白间接竞争性ELISA检测方法，该法检出限为 （0.72±0.035）μg／mL；吉坤美等［36］建立了食物中花生过敏原蛋白的双抗体夹心ELISA检测法，该法特异性强，其最低检出限为8ng／mL。上述研究表明ELISA技术是一种实用、灵敏、特异性强的食品中过敏原的检测方法。

2.8 食品中违法添加的非食用物质的检测

违法添加非食用物质和滥用食品添加剂是导致食品质量安全问题的重要原因之一。近年来出现的如瘦肉精、三聚氰胺以及苏丹红等食品安全事件，反映出当前在食品生产和加工过程中滥用食品添加剂和违法添加非食用物质的问题十分严重。因此，ELISA技术作为一种简单、经济以及快速的检测方法对于食品中违法添加剂的分析检测尤为重要。王黎丽等［37］建立了基于单克隆抗体的三聚氰胺间接和直接竞争性ELISA检测方法，2种检测法的检测限分为0.079μg／L和0.12μg／L；郭杰标等［38］建立了保健酒中非法添加双氯芬酸的竞争性ELISA检测方法，其最低检出限为2.0ng／mL，与8种相关药物交叉反应率都小于0.1%。范祚舟［39］建立了一种能够快速检测食品中苏丹红的间接竞争性ELISA检测法，对于苏丹红I检测的IC50为0.34ng／mL；汪惠泽［40］建立了样品中盐酸克伦特罗的间接竞争性ELISA检测方法，该法检测限低于0.5ng／mL，交叉实验表明，该法具有高度的特异性，与其他一些P－肾上腺素激动剂药物无交叉反应。

3 ELISA技术存在的主要问题

与其他分析检测技术相比，ELISA技术的优势在于特异性强、灵敏度高、测定成本低、样品处理量大、对仪器设备要求不高、方法快速简便、自动化程度高、无放射性同位素污染等，但其在食品安全检测的应用过程中也存在着一些问题。首先，该方法需要较多的仪器设备，如酶标仪、冰箱及恒温箱等，不适宜基层现场检测。其次抗体制备较困难。一方面，一些单克隆抗体制备的时间较长 （至少2个月），另一方面有些被检测样品分子量小，必须与BSA等大分子蛋白质偶联后才具备免疫原性，而且并非所有的小分子被检样品都能制备出用于免疫分析的抗体，因为其受该物质的结构和载体蛋白的连接位置等多种因素的影响。再次，对与待检样品结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，容易出现假阳性，将导致定量检测准确度降低。此外，由于食品的样本类型复杂，基质效应可能抑制免疫结合反应。不同待测样品性质各异，处理方法存在许多不确定性，同时抗体特异性和稳定性对检测结果影响机制尚不清楚，影响其特异性和稳定性的因素还不是很明确，使得不确定因素增多且不易控制，难以实现标准化。

4 ELISA技术的发展趋势与应用前景

目前，ELISA技术在食品安全检测中的应用越来越广泛，伴随科学技术的进步，该技术必将产生新的发展趋势，具体内容如下：开发具有高度免疫性的重组抗原来代替无法分离的原始抗原物质以提高其免疫原性；将酶体外定向进化应用到检测中 （一种同时具有催化底物显色反应的酶活性和特异性抗体或抗原性质的融合蛋白），避免酶与特异性抗体或抗原的化学交联过程，从而大大地提高检测结果的稳定性和重复性；加强标准化，促进商品化的应用；与其他检测方法如PCR、色谱技术等相结合，实现强强联合，扩大其优势、改善弊端。随着研究的不断深入，相信ELISA技术的应用范围会越来越广，检测限会越来越低，稳定性越来越强，检测时间越来越短，费用越来越低，ELISA技术在未来食品安全的快速检测中将发挥更加突出和重要的作用，从而使食品安全检测技术愈加精确、简单、方便。

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