水稻抗稻瘟病遗传与基因克隆研究进展

敖俊杰，胡慧，李俊凯，张陈玲

邢家宝，唐静，江广帅 长江大学农学院，湖北荆州434025

杜斌，邱先进 长江大学农学院，湖北荆州434025； 主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北 荆州434025

徐建龙 长江大学农学院，湖北 荆州434025；主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心， 湖北 荆州434025；中国农业科学院作物科学研究所，北京100081

邢丹英，杨隆维 长江大学农学院，湖北荆州434025； 主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北 荆州434025

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食［1，2］。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的一种真菌性病害，是水稻的三大病害之一，对世界水稻产量造成了非常大的影响，每年因为稻瘟病造成的水稻产量损失达到11%～13%，而中国每年稻瘟病发病面积达到380万hm2以上，稻谷损失达到数亿千克［3］，对我国粮食安全造成了巨大威胁。我国南方是稻瘟病流行的重灾区，流行年份一般造成产量损失达20%，严重年份可达40%以上［4］。此外，稻瘟病还能导致水稻品质下降［5］。因此，如何防治稻瘟病的发生，将稻瘟病的损失降到最低，是世界各国水稻生产的重要任务。目前，化学防治和培育抗病品质是防治稻瘟病的主要方式。其中，培育抗稻瘟病的水稻品种是控制稻瘟病最经济、最有效的方法［6］。因此，发掘和鉴定抗稻瘟病基因，研究其遗传机理，并应用到分子育种中培育抗稻瘟病的水稻品种具有重要意义。笔者综述了水稻稻瘟病的发病机理、遗传基础、QTL定位和基因克隆的研究进展，以期为分子育种培育抗稻瘟病的水稻新品种提供参考。

1 稻瘟病的发病机理

稻瘟病的发病是一个非常复杂的过程，包括稻瘟病菌分生孢子的产生和萌发、附着胞形成、侵染钉分化和侵染性菌丝扩展等。稻瘟病菌主要以分生孢子和菌丝的形式在病稻和稻谷上越冬。第二年，当达到合适温度和湿度 （通常20℃以上的阴雨天）时，稻瘟病菌产生大量的分生孢子，并借助风力传播。当分生孢子接触到宿主时，其尖端便释放出粘胶和芽胞使其紧紧地吸附在宿主身上。接着分生孢子便萌发形成芽管，芽管继而分化出附着胞，之后产生侵染栓穿透宿主组织的角质层和表皮细胞壁，并在宿主细胞中生长，侵染临近细胞并深入叶肉细胞［7～11］。一般稻瘟病侵染水稻5～7d后才表现出症状，在侵染结束后，被侵染的细胞又能产生新的菌丝和分生孢子并从病斑处释放出来，借助风力再次传播，造成重复侵染［12］。

根据稻瘟病菌侵染水稻的部位不同，稻瘟病又可以分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟［13］。其中叶瘟和穗颈瘟发病最为常见，危害也最大，稻瘟病的评价体系中也最受重视。叶瘟主要发生在水稻三叶期到抽穗期，其中较为集中发病的时期是秧苗分蘖期至拔节期。而穗颈瘟主要发生在抽穗以后，造成水稻结实率下降，重者形成白穗。

2 稻瘟病抗性的遗传基础

稻瘟病抗性是一个典型的数量性状，遗传十分复杂。最早对稻瘟病抗性进行遗传研究的是日本学者［14］，但是进展十分缓慢，直到20世纪60年代才有人系统地进行稻瘟病性遗传研究。中国的稻瘟病抗性研究开始于20世纪70年代，1976～1979年完成的全国稻瘟病菌生理小种鉴定为抗稻瘟病基因鉴定打下了很好的基础［15］。一般认为，稻瘟病抗性由1～2个抗性基因控制，有些由3个或更多主效基因控制，当然有些也由一些隐性或不完全显性抗病基因控制，不同抗病基因之间相互独立或存在互作关系［16～17］。此外，还有些抗稻瘟病基因在染色体相近的位点存在连锁现象，有些抗病基因还受修饰基因的影响。

3 稻瘟病抗性QTL定位

在分子标记技术发展之前，人们一般利用遗传群体结合经典的数量遗传学方法对稻瘟病抗性进行遗传研究，这种方法是将影响稻瘟病的基因作为整体来进行的，无法将多个基因分解为单个孟德尔因子进行剖析。近年来，随着分子生物学的发展，国内外研究者都利用分子标记技术 （特别是SSR分子标记技术）构建了许多不同类型的遗传群体，将控制稻瘟病抗性的基因定位到了染色体比较精细的位置。

稻瘟病抗性基因的来源十分丰富，这给研究者们提供了很好的研究材料。其中，供体亲本有各地最常见的主栽品种，如特青［18］、三黄占2号［19］等，此外还有一些野生稻和农家品种。徐吉臣等［20］利用“ZYQ7”和 “JX17”构建的双单倍体群体，共鉴定出控制稻瘟病20个生理小种抗性的124个抗性QTL，分布于全部12条染色体上的72个区域。杨小林等［21］利用农家品种 “魔王谷”和粳稻品种 “鄂晚8号”构建的双单倍体群体，共定位到3个影响稻瘟病5个鉴别菌株抗性的主效QTL，这3个QTL均位于水稻第6染色体RM541附近，说明该区域可能存在一个广谱抗稻瘟病的主效QTL。另外，不同的研究者还构建了许多其他类型的群体，例如F2群体、重组自交系群体、高世代回交群体和染色体片段代换系群体等，都对稻瘟病抗性QTL基因型了分析［22～30］。据不完全统计，到目前为止不同的研究者利用不同的研究群体定位了超过86个影响水稻稻瘟病的主效QTL，另外还定位了超过350个微效QTL［31～33］。何秀英等［31］对已经定位到的这86个主效QTL的相关信息进行了整理，这些已定位的稻瘟病抗性主效QTL分布于除第3染色体外的所有染色体上，其中大部分分布于第6、11和12染色体，这3条染色体上都存在着一个很大的QTL簇，能够为分子育种改良稻瘟病抗性提供抗源。

4 稻瘟病抗性基因克隆

20世纪50年代DNA双螺旋结构发现以后，基因组学和分子生物学的发展日新月异。随着新技术的不断发明，研究者有机会克隆稻瘟病抗性基因，并探明这些基因的功能。迄今为止，水稻中共鉴定和克隆了21个稻瘟病抗性基因。

Pib基因是第一个克隆的水稻稻瘟病抗性基因，它位于第2染色体长臂末端，编码一个含有1251个氨基酸的蛋白质，对大部分日本稻瘟病生理小种都具有抗性［25］。后来克隆的稻瘟病抗性基因大部分也都分布于第6和11染色体，这与稻瘟病抗性QTL的分布一致。

第6染色体上克隆的稻瘟病抗性基因有Pi9、Pi2、Piz-t、Pi-d2、Pid3和Pi25。Pi9编码的蛋白含有1032个氨基酸，该蛋白质含有1个NBS-LRR结构域，在水稻中呈现组成型表达，对稻瘟病具有广谱抗性［34］。Pi2编码蛋白含有1032个氨基酸的蛋白质，与Piz-t编码的蛋白质只有8个氨基酸的差异，不过也就是这8个氨基酸的差异造成了2个基因抗性专化的差别［35］。Pi-d2编码1个凝集素类受体蛋白，全长825个氨基酸，抗病基因编码蛋白的第441个氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸后，该基因即失去抗病特性而转变成为感病基因［36］。第11染色体上克隆的稻瘟病抗性基因有Pik-m、Pik-p、Pik、Pi1、Pik-h／Pi54、Pb1和Pia，其中只有Pik-m是通过图位克隆的方法克隆到的。Pik-m 由2个紧密连锁并具有独立功能的NBS-LRR类基因组成，这2个基因分别编码1141和1021个氨基酸组成的蛋白质［37］。

5 展望

稻瘟病抗性是水稻中最重要的性状之一，它关系到水稻最终产量的形成，对保障粮食安全具有重要意义。通过克隆影响稻瘟病抗性的基因，揭示其分子机理和遗传基础，再建立适合的分子标记育种体系，将不同的稻瘟病抗性基因聚合在一起，能够不断提高水稻的稻瘟病抗性，延长水稻品种的生产寿命。虽然研究者们克隆了一些影响水稻稻瘟病抗性的基因，但是不同基因之间的调控网络还未建立，抗性基因的分子机理还未完全揭示。随着水稻分子生物学和功能基因组的不断发展，相信在不久的将来，人们一定能克隆更多影响稻瘟病抗性的基因，弄清稻瘟病抗性的遗传基础和调控网络，并设计相应的分子标记，通过分子设计育种培育出抗稻瘟病的高产水稻新品种。

［1］Zhang Q F.Strategy of developing green super rice［J］.Proc Natl Acad Sci，2007，104：16402～16409.

［2］FAO.FAO statistical yearbook 2013 ［EB／OL］.http：／／www.fao.org／docrep／018／i3107e／i3107e00.htm，2013-12-01.

［3］孙漱沅，孙国昌.我国稻瘟病研究的现状和展望 ［J］.植物技术与推广，1996，16（3）：39～40.

［4］齐龙，马旭，梁柏，等.稻瘟病监测预测方法研究现状及流行风险评估体系构建初探 ［J］.中国农学通报，2011，27（33）：213～216.

［5］江南，刘雄伦，戴良英，等.水稻抗稻瘟病基因的定位与克隆研究进展 ［J］.中国农学通报，2010，26（10）：270～275.

［6］Zhang Y X，Yang J Y，Shan Z L，et al.Substitution mapping of QTLs for blast resistance with SSSLs in rice（Oryza sativa L.）［J］.Euphytica，2012，184：141～150.

［7］Balhadere P V，Talbot N J.PDE1encodes a P-type ATPase involved in appressorium-mediated plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe grisea［J］.Plant Cell，2001，13：1987～2004.

［8］Banno S，Kimura M，Tokai T，et al.Corning and characterization of genes specifically expressed during infection stages in the rice blast fungus［J］.FEMS Microbiology Letters，2003，222：221～227.

［9］Beckerman J L，Ebbole D J.MPG1，agene encoding a fungal hydrophobin of Magnaporthe grisea，is involved in surface recognition［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，1996，9：450～456.

［10］Froeliger E H，Carpenter B E.NUT1，a major nitrogen regulatory gene in Magnaporthe grisea，is dispensable for pathogenicity［J］.Molecular ＆General Genetics，1996，251：647～656.

［11］Hamer J E，Talbot N J.Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea ［J］.Current Opinion Microbiology，1998，1：693～697.

［12］李杨，王耀雯，王育荣，等.水稻稻瘟病菌研究进展 ［J］.广西农业科学，2010，41（8）：789～792.

［13］谭家莉.水稻稻瘟病的发病原因和综合防治 ［J］.农技服务，2014，31（8）：32～34.

［14］Sasaki R.Existence of strains in rice blast fungus［J］.Japanese Journal of Plant Protection，1922，9：631～644.

［15］凌忠专.稻瘟病研究论文集 ［M］.北京：中国农业出版社，2005：231～242.

［16］雷财林，凌忠专，王久林，等.水稻抗病育种研究进展 ［J］.生物学通报，2004，39（11）：4～7.

［17］何秀英，廖耀平，陈钊明，等.水稻稻瘟病抗病育种研究进展与展望 ［J］.广东农业科学，2011，（1）：30～33.

［18］Tabien R E，Li Z，Paterson A H，et al.Mapping of four major rice blast resistance genes from“Lemont”and“Teqing”and evaluation of their combinatorial effect for field resistance［J］.Theor Appl Genet，2000，101：1215～1225.

［19］Liu Y，Liu B，Zhu X，et al.Fine-mapping and molecular marker development for Pi56 （t），a NBS-LRR gene conferring broadspectrum resistance to Magnaporthe oryzae in rice［J］.Theor Appl Genet，2013，126：985～998.

［20］徐吉臣，王久林，凌忠专，等.利用QTL定位分析水稻的稻瘟病抗性基因 ［J］.科学通报，2004，49（2）：245～251.

［21］杨小林，戚华雄，殷得所，等.水稻稻瘟病抗性QTL的等位分析 ［J］.植物病理学报，2014，42（6）：600～607.

［22］Chen S，Wang L，Que Z，et al.Genetic and physical mapping of Pi37 （t），a new gene conferring resistance to rice blast in the famous cultivar St.No.1 ［J］.Theor Appl Genet，2005，111：1563～1570.

［23］Zhu M，Wang L，Pan Q.Identification and Characterization of a new blast resistance gene located on rice chromosome 1through linkage and differential analyses［J］.Phytopathology，2004，94：515～519.

［24］Nguyen T T，Koizumi S，La T N，et al.Pi35 （t），a new gene conferring partial resistance to leaf blast in the rice cultivar Hokkai 188 ［J］.Theor Appl Genet，2006，113：697～704.

［25］Wang Z X，Yano M，Yamanouchi U，et al.The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes［J］.The Plant Journal，1999，19：55～64.

［26］Pan Q H，Wang L，Ikehashi H，et al.Identification of two new genes conferring resistance to rice blast in the Chinesenative cultivar“Maowangu”［J］.Plant Breeding，1998，117：27～31.

［27］Pan Q H，Wang L，Tanisaka T.A new blast resistance gene identified in the Indian native rice cultivar Aus373through allelism and linkage tests［J］.Plant Pathology，1999，48：288～293.

［28］Chen X W，Li S G，Xu J C，et al.Identification of two blast resistance genes in a rice variety，Digu ［J］.Journal of Phytopathology，2004，152：77～85.

［29］Zhou J H，Wang J L，Xu J C，et al.Identification and mapping of a rice blast resistance gene Pi-g （t）in the cultivar Guangchangzhan ［J］.Plant Pathology，2004，53：191～196.

［30］Fukuoka S，Okuno K.QTL analysis and mapping of pi21，a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese upland rice［J］.Theor Appl Genet，2001，103：185～190.

［31］何秀英，王玲，吴伟怀，等.水稻稻瘟病抗性基因的定位、克隆及育种应用研究进展 ［J］.中国农学通报，2014，30（6）：1～12.

［32］Ballini E，Morel J，Droc G，et al.A genome-wide meta-analysis of rice blast resistance genes and quantitative trait loci provides new insights into partial and complete resistance［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2008，21：859～868.

［33］杨勤忠，林菲，冯淑杰，等.水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究进展 ［J］.中国农业科学，2009，42（5）：1601～1615.

［34］Qu S，Liu G，Zhou B，et al.The broad-spectrum blast resistance gene Pi9encodes a nucleotide-binding site——leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice［J］.Genetics，2006，172：1901～1914.

［35］Zhou B，Qu S H，Liu G F，et al.The eight amino-acid differences within three leucine-rice repeats between Pi2and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea ［J］.Mol Plant Microbe In.2006，19：1216～1228.

［36］Chen X W，Shang J J，Chen D X，et al.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance ［J］.Plant J，2006，46：794～804.

［37］Ashikawa I，Hayashi N，Yamane H，et al.Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance［J］.Genetics，2008，180：2267～2276.