解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素应用于系统性红斑狼疮小鼠的疗效观察及机制探讨

项晓骏，陈红波，叶黎青，马红珍



·中医·中西医结合研究·

解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素应用于系统性红斑狼疮小鼠的疗效观察及机制探讨

项晓骏，陈红波，叶黎青，马红珍

目的 探讨解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素应用于系统性红斑狼疮小鼠的疗效和机制。方法 2012年4月—2014年5月选取60只MRL/lpr小鼠采用随机数字表法分为3组，模型组20只，西药组20只，联合组20只；同时选取20只健康昆明小鼠作为空白对照组。空白对照组和模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃；西药组给予0.5 g/ml泼尼松混悬液灌胃；联合组给予1.0 g/ml泼尼松混悬液联合解毒祛瘀滋阴汤剂。比较各组小鼠的死亡率、外周血淋巴细胞(PBLC)凋亡率、皮质醇水平和糖皮质激素受体(GR)mRNA表达水平。结果 干预12周后，空白对照组、模型组、西药组、联合组小鼠分别死亡0只、11只(55%)、7只(35%)、3只(15%)，差异有统计学意义(χ2=5.237，P<0.05)。培养24 h和48 h时，模型组和西药组PBLC凋亡率低于空白对照组(P<0.05)；西药组和联合组高于模型组(P<0.05)；联合组高于西药组(P<0.05)。各组小鼠皮质醇水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中西药组和联合组高于空白对照组和模型组(P<0.05)；联合组低于西药组(P<0.05)。各组小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组、西药组和联合组低于空白对照组(P<0.05)；西药组和联合组低于模型组(P<0.05)；联合组高于西药组(P<0.05)。结论 解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素应用于系统性红斑狼疮小鼠可改善其死亡情况，疗效优于西药单独应用，机制可能与降低皮质醇水平、升高GR mRNA表达水平有关。

红斑狼疮,系统性；解毒剂(中药)；祛瘀；滋阴；方剂；糖皮质激素类；小鼠

项晓骏，陈红波，叶黎青，等.解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素应用于系统性红斑狼疮小鼠的疗效观察及机制探讨[J].中国全科医学，2015，18(21)：2589-2593.[www.chinagp.net]

Xiang XJ，Chen HB，Ye LQ，et al.Curative effect and mechanism of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid in treatment of mice with systemic lupus erythematosus[J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2589-2593.

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种可以累及全身多脏器的自身免疫性炎性结缔组织疾病，多发于青年女性[1]。其发病机制与多种因素有关，致病因素共同作用导致淋巴细胞凋亡受阻，产生大量自身抗体，抗原-抗体结合物沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位，引起慢性炎症及组织损伤[2-3]。糖皮质激素(glucocorticoid)是治疗不同阶段、不同类型SLE的首选药物，但长期应用可导致多种不良反应，部分患者可能出现耐药性[4]。本研究选取60只MRL/lpr小鼠作为观察对象，研究解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素应用于SLE小鼠的疗效和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2012年4月—2014年5月选取60只雌性MRL/lpr小鼠，7～8周龄；体质量19～23 g，平均(20.4±1.2)g；20只雌性健康昆明小鼠，7～8周龄；体质量20～23 g，平均(20.9±0.8)g，均由浙江中医药大学实验动物中心提供。小鼠在实验前均在SPF动物房中进行4周隔离培养。

1.2 药品 解毒祛瘀滋阴方(蚤休15 g、鳖甲12 g、青蒿30 g、白花蛇舌草30 g、赤芍12 g、积雪草12 g、升麻12 g、生地18 g、制首乌15 g等12味中药)由浙江省中医院中医科自行配制，用水煎至含药浓度为1.0 g/ml的汤剂；醋酸泼尼松片(天津力士制药股份有限公司，批号：1006040)用0.9%氯化钠溶液配制成0.5 g/ml 和1.0 g/ml的混悬液。

1.3 主要试剂和仪器 试剂：小鼠淋巴细胞分离液(美国MP Biomedicals公司)，Annexin V凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，皮质醇酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海通蔚实业有限公司)，RNA提取试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)，糖皮质激素受体(GR)mRNA(广州欧谱生物科技有限公司)，其他生化试剂均购自生兴生物技术(南京)有限公司。仪器：二氧化碳(CO2)培养箱(常州恒德仪器制造有限公司)，流式细胞仪(山东莱索科技有限公司)，聚合酶链反应(PCR)仪(杭州晶格科学仪器有限公司)。

本研究创新点：

系统性红斑狼疮(SLE)是一种可以累及全身多脏器的自身免疫性炎性结缔组织疾病，目前，临床上糖皮质激素是治疗不同阶段、不同类型SLE的首选药物，但长期应用可导致多种不良反应，部分患者可能出现耐药性并加大用药剂量，导致恶性循环。目前，中西医临床上对于这一问题尚缺乏有效的解决方案。而根据中医理论，SLE常表现为热毒内盛，耗伤肾阴致阴血亏虚，热盛阴亏易致瘀血，糖皮质激素属阳热之品，应用后更致阴液耗伤，而解毒祛瘀滋阴方具有清热解毒、活血化瘀和滋阴养肾的功效，可以有效缓解SLE症状。本研究通过中西医结合的方式，将中医传统方剂解毒祛瘀滋阴方与经典用药糖皮质激素联合应用，探讨解毒祛瘀滋阴方在改善糖皮质激素导致的耐药性中的应用价值。

1.4 方法

1.4.1 小鼠分组和药物处理 20只健康昆明小鼠作为空白对照组，采用0.9%氯化钠溶液灌胃，0.5 ml/d；将60只MRL/lpr小鼠采用随机数字表法分为3组，模型组20只，采用0.9%氯化钠溶液灌胃，0.5ml/d；西药组20只，采用0.5 g/ml泼尼松混悬液灌胃，0.5 ml/d；联合组20只，采用1.0 g/ml泼尼松混悬液灌胃，0.25 ml/d，同时联合解毒祛瘀滋阴汤剂，0.25 ml/d。均饲养12周。

1.4.2 外周血淋巴细胞(PBLC)凋亡率检测 (1)PBLC的分离和培养：在无菌室内经尾静脉注射10%乌拉坦(1.5 ml/kg)麻醉小鼠，打开小鼠的胸腹腔，经心脏取血5 ml。取小鼠肝脏备用。将1.5 ml血液、2 ml磷酸盐缓冲液(PBS)和2 ml淋巴细胞分离液加入8 ml离心管中，混匀后在4 ℃离心机中以2 500 r/min(离心半径3.0 cm)离心20 min，小心吸取血液和分离液之间的淋巴细胞悬液，并移入EP管中，4 ℃，1 000 r/min(离心半径3.0 cm)离心5 min，弃上清液；加入500 μl PBS，4 ℃ 1 000 r/min(离心半径3.0 cm)离心5 min，取上清液后加入PBS制备淋巴细胞混悬液，细胞浓度为1×106个/L。将制备好的混悬液加入24孔板中，在37 ℃的5%CO2培养箱中进行培养。分别收取培养0、24、48 h的细胞悬液进行检测。(2)流式细胞仪检测PBLC凋亡率：将上述单细胞悬液以1 000 r/min(离心半径3.0 cm)离心5 min，PBS洗涤细胞后调整细胞浓度为1×109个/L。在细胞悬液中加入经过预冷的结合缓冲液、5×10-6/L的Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)液和10×10-6/L的PI液，混匀后于室温下避光放置15 min后用流式细胞仪检测PBLC凋亡率。

1.4.3 小鼠皮质醇水平检测 将2 ml血液样本(无菌，心脏取血)加入离心管中，4 ℃ 3 000 r/min(离心半径3.0 cm)离心10 min,取上清液，应用皮质醇ELISA试剂盒检测血清中的皮质醇水平。

1.4.4 小鼠GR mRNA表达水平检测 采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测小鼠GR mRNA，取小鼠肝组织100 mg,剪碎后用2.5%胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，1 000 r/min(离心半径3.0 cm)离心5 min。应用RNA提取试剂盒提取细胞的mRNA，所有操作严格按照说明书进行。选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，对内参和目标基因的mRNA进行反转录,获得cDNA。将cDNA进行扩增，反应体系为25 μl。反应条件：94 ℃变性5 min，94 ℃ 1 min，5 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，顺序循环35次，72℃延伸5 min，产物于4 ℃保存。运用琼脂糖凝胶电泳检测各组小鼠的GRα mRNA和GRβ mRNA表达水平。

2 结果

2.1 各组小鼠死亡率比较 干预12周后，空白对照组无小鼠死亡，模型组11只(55%)小鼠死亡，西药组7只(35%)小鼠死亡，联合组3只(15%)小鼠死亡，各组小鼠死亡率比较，差异有统计学意义(χ2=5.237，P<0.05)。

2.2 各组小鼠不同时间PBLC凋亡率比较 培养0 h时，4组间PBLC凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；培养24 h和48 h时，4组间PBLC凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。培养24 h和48 h时，模型组和西药组PBLC凋亡率低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；西药组和联合组高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；联合组高于西药组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 各组小鼠皮质醇水平比较 各组小鼠皮质醇水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中西药组和联合组高于空

白对照组和模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；联合组低于西药组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 1 Comparison of PBLC apoptosis rates of mice among different groups at different time points

组别只数PBLC凋亡率0h 24h 48h空白对照组203.77±1.2413.85±2.6425.97±4.35模型组92.18±0.893.76±1.02a5.17±1.81a西药组134.52±1.698.94±1.89ab17.85±3.17ab联合组174.31±1.4711.97±2.06bc24.35±3.99bcF值2.1795.1786.980P值0.1260.0370.025

注：PBLC=外周血淋巴细胞；与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与西药组比较，cP<0.05

表2 各组小鼠皮质醇水平比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与西药组比较，cP<0.05

2.4 各组小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表达水平比较 各组小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组、西药组和联合组低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；西药组和联合组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；联合组高于西药组，差异有统计学意义(P<0.05，见图1、表3)。

注：A为空白对照组，B为模型组，C为西药组，D为联合组

图1 各组小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表达水平

Figure 1 Expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA of mice among different groups

Table 3 Comparison of expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA of mice among different groups

组别只数GRαmRNAGRβmRNA空白对照组200.651±0.0850.271±0.035模型组90.476±0.062a0.132±0.017a西药组130.252±0.024ab0.072±0.009ab联合组170.355±0.051abc0.110±0.012abcF值6.3436.892P值0.0310.028

注：GR=糖皮质激素受体；与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与西药组比较，cP<0.05

3 讨论

SLE是一种较为常见的自身免疫性的炎症性结缔组织疾病，多发于育龄女性，可累及全身多个器官和组织[5]。SLE患者的淋巴细胞凋亡受阻，产生大量自身抗体，形成的免疫复合物沉积在不同组织，在补体的作用下引起组织损伤[6]。目前，糖皮质激素是治疗SLE的首选药物，药物作用的关键环节是糖皮质激素与GR的结合，从而发挥药理作用，调节机体的免疫功能[7]。临床研究发现，糖皮质激素的长期应用不仅可以导致多种不良反应的发生，部分患者还可以出现耐药性，这可能与细胞GR表达水平的下降有关[8]。

MRL/lpr小鼠的Fas 基因出现凋亡相关突变，淋巴细胞和巨噬细胞存在凋亡缺陷，T细胞过度增生，从而产生大量的类风湿相关的因子，因此MRL/lpr小鼠是研究SLE较为理想的动物模型[9]。本研究选取60只MRL/lpr小鼠作为观察对象，同时选取20只健康昆明小鼠作为空白对照组，研究解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素应用于SLE小鼠的疗效和机制。经过12周的干预后，模型组11只小鼠死亡，西药组7只，高于空白对照组；联合组3只小鼠死亡，低于模型组和西药组。分离并培养小鼠的外周血淋巴细胞，比较各组小鼠PBLC凋亡率，24 h和48 h时有差异：模型组小鼠PBLC凋亡率低于空白对照组，说明MRL/lpr小鼠存在淋巴细胞凋亡障碍；西药组小鼠PBLC凋亡率高于模型组，说明糖皮质激素的应用可以促进PBLC的凋亡并降低小鼠的死亡率；联合组小鼠PBLC凋亡率高于西药组，且与空白对照组无统计学差异，小鼠死亡率较低，故解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素治疗SLE的疗效优于单纯应用糖皮质激素[10]。

各组小鼠的皮质醇水平可以反映小鼠应用糖皮质激素后的血清药物浓度[11]，模型组小鼠和空白对照组小鼠的皮质醇水平无统计学差异，与上述两组小鼠相比，西药组和联合组小鼠皮质醇水平升高，联合组小鼠皮质醇水平低于西药组。研究发现，糖皮质激素治疗SLE的疗效取决于药物与GR的结合，而长期应用糖皮质激素可以下调GR水平，其机制较为复杂，主要从mRNA水平抑制GR表达[12]。与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠的GRα mRNA和GRβ mRNA表达水平下降，西药组小鼠的GR mRNA表达水平低于模型组，说明糖皮质激素可以通过下调GR表达水平诱导耐药性[13]。与西药组小鼠相比，联合组小鼠的GRα mRNA和GRβ mRNA表达水平升高，说明解毒祛瘀滋阴方的应用可以拮抗糖皮质激素对GR表达的抑制作用；同时联合治疗可以降低小鼠的血清皮质醇水平，减轻因为大量应用糖皮质激素造成的不良反应。

根据中医理论，SLE常表现为热毒内盛，耗伤肾阴致阴血亏虚，热盛阴亏易致瘀血；糖皮质激素属阳热之品，应用后更致阴液耗伤。解毒祛瘀滋阴方具有清热解毒、活血化瘀和滋阴养肾的功效，可以有效缓解SLE症状。生地黄具有清热凉血养阴的功效，配伍具有清热解毒作用的白花蛇舌草、积雪草和升麻，赤芍活血散瘀，鳖甲、制首乌养阴益肾，蚤休调节免疫，青蒿退热、梳理少阳气机，诸药成方后可以有效发挥清热解毒和养阴的作用[14-15]。

综上所述，解毒祛瘀滋阴方联合糖皮质激素对SLE的疗效优于西药单独应用，其作用机制可能与GR的表达有关。本研究尚存在以下局限性：研究以小鼠为观察对象，因实验材料的制约，研究持续12周，时间较短；实验过程中，未根据各组小鼠有无耐药情况调整糖皮质激素的剂量，故难以明确解毒祛瘀滋阴方能否减少糖皮质激素的用量；同时，本研究尚未明确解毒祛瘀滋阴方是否可以减轻SLE患者长期用药的不良反应。上述问题的解决寄希望于进一步的动物实验和未来临床试验的开展。

利益冲突声明：本课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益赞助。无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Curative Effect and Mechanism of Jieduquyuziyinfang Combined With Glucocorticoid in Treatment of Mice With Systemic Lupus Erythematosus

XIANGXiao-jun，CHENHong-bo，YELi-qing，etal.

DepartmentofNephrology,ZhejiangProvincialHospitalofTCM,Hangzhou310014,China

Objective To study the curative effect and mechanism of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid in treatment of mice with systemic lupus erythematosus.Methods 60 MRL/lpr mice were equally divided into 3 groups by random number table method:model group,western medicine group,and combined treatment group;20 healthy Kunming mice were chosen as blank control group from April 2012 to May 2014.Mice in blank control group and model group received intragastric administration of 0.9% sodium chloride solution;mice in western medicine group received intragastric administration of 0.5 g/ml metacortandracin suspension;mice in combined treatment group received intragastric administration of 1.0 g/ml metacortandracin suspension and Jieduquyuziyin decoction.The rate of death,rate of PBLC apoptosis,levels of CORT and GR mRNA were compared among different groups.Results 12 weeks after treatment,0 case in blank control group,11 cases(55%) in model group,7 cases(35%) in western medicine group and 3 cases(15%) in combined treatment group mice died,there were significant differences in the rate of death among different groups(χ2=5.237,P<0.05).24 h and 48 h after treatment,the rate of PBLC apoptosis in model group and western medicine group was significantly lower than that in blank control group,respectively;the rate of PBLC apoptosis in western medicine group and combined treatment group was significantly higher than that in model group(P<0.05);the rate of PBLC apoptosis in combined treatment group was significantly higher than that in western medicine group(P<0.05).There were significant differences in level of peripheral blood CORT among different groups of mice(P<0.05),level of peripheral blood CORT in western medicine group and combined treatment group was significantly higher than that in blank control group and model group,respectively(P<0.05);level of peripheral blood CORT in combined treatment group was significantly lower than that in western medicine group(P<0.05).There were significant differences in expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA among different groups of mice(P<0.05);expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA in model group,western medicine group and combined treatment group were significantly lower than those in blank control group,respectively(P<0.05);expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA in western medicine group and combined treatment group were significantly lower than those in model group,respectively(P<0.05);expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA in combined treatment group were significantly higher than those in western medicine group(P<0.05).Conclusion Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid can reduce the rate of death among mice with systemic lupus erythematosus,the curative effect of which is better than that of western medicine,the mechanism may be related to the reduction effect of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid on CORT level and the enhancement effect of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid on GR mRNA expression level.

Lupus erythematosus,systemic；Antidotic agents(TCD)；Removing blood stasis；Nourishing yin；Chinese medical formula；Glucocorticoids；Mice

国家自然科学基金资助项目(81202673)

310014浙江省杭州市，浙江省中医院肾内科

项晓骏，310014浙江省杭州市，浙江省中医院肾内科；E-mail:xiangxiaojunzj@163.com

R 593.241

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.021

2014-12-08；

2015-03-23)