多参数流式细胞仪在检测急性髓系白血病微小残留病灶中的运用

魏 佳综述，李惠民审校

（昆明医科大学第一附属医院血液科 650032）

急性髓系白血病（AML）并非是一种单一的疾病，而是一组具有不同形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学特征的异质性、克隆性造血干／祖细胞疾病。通过化疗能使大部分AML患者缓解，完全缓解（CR）率达50%～80%[1]，但仍有约65%的患者最终在3～5年内复发，提示目前的治疗方案尚不能完全清除体内的病变细胞，而这些残留的白血病细胞，即微小残留病灶（MRD），是最终复发的根源[2-3]。目前用于MRD的检测方法有经典的细胞形态学方法、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR、RQ-PCR）、多参数流式细胞仪（MFC）和荧光原位杂交（FISH）。MFC、PCR是临床上最常用的检测手段，二者的出现打破了单纯依靠细胞形态学来定义CR的局限性。MFC可在短时间内分析大量白血病细胞检测MRD，能够提供独立预后信息和及时、可靠的临床一手资料，指导制订个体化的治疗方案，达到降低复发率和延长生存期的目的。

1 白血病细胞的免疫表型特点

白血病相关免疫表型（LAIPs）在正常骨髓或外周血细胞上不表达或低表达，而在白血病细胞上表达或高表达。AML中的LAIPs具有以下特点：（1）抗原跨系表达（如CD2、CD4、CD5、C7、C10、C19、C56）；（2）抗原跨阶段表达（如CD34＋／CD11＋，CD34＋／CD15＋）；（3）抗原的过度表达、低表达或缺失（如CD34、CD13、CD38、CD33和HLA-DR等抗体的荧光强度明显增强或减弱）；（4）光散射异常（CD13＋光散射异常）[4]。这些抗原异常表达的特点成为识别白血病细胞，检测MRD的基础。

2 MFC检测MRD的适用范围与优势

聚合酶链反应（PCR）虽然特异性和敏感性高，但AML中存在合适的目标分子（如：PML-RARa、AML-ETO、CBFβ-MHY11等）加上FLT3、NPM1等基因突变的患者仅占60%～70%[5]，因此运用局限。并且白血病细胞在克隆演变的过程中可能发生靶基因长度和位点的变化，甚至出现新的突变基因，将导致PCR法检测的漏诊和监测的中断，意味着将有更多的患者无法用PCR对MRD实行有效的监测。

MFC可以在短时间内对大量单个核细胞进行多参数分析，是AML患者检测MRD的有效方法[6]。美国St Jude儿童医院AML02研究中检测到95%的AML患者存在LAIPs，MFC适用于几乎所有AML患者[7]。运用MFC的检测方法不仅能准确定量残留白血病细胞数，还可以进一步分析残留白血病细胞的增殖、凋亡及耐药等生物学特性，反映白血病细胞对化疗的敏感性、自身生物学特性及体内肿瘤负荷情况。此外，MFC可以在同一次检测中追踪多个异常的免疫表型，在MRD检测时只需要一种异常分子标志即可被检出，不会像基因突变那样影响检测效能。但AML细胞在复发时出现“抗原漂移”的频率高，因此目前建议诊断时至少需要记录2个异常免疫表型用于以后的MRD检测。初诊时全面而完整的免疫表型分析、个体化设计表型组合、多个白血病相关标志联合等策略均能增加MFC检测结果的可信度。

3 MFC检测MRD的敏感性

影响检测的灵敏度、特异性的因素有：（1）恶性细胞缺乏抗原特异性；（2）一些小克隆的亚群存在并且很难识别；（3）表型转换无法识别；（4）缺乏有经验和专业技术的工作人员。当灵敏度达10-5～10-4，标本需要的有核细胞数约500 000个，保证样本质量是保证灵敏度的前提。MD安德森癌症中心[4]采用的是8色的流式细胞仪，检测时标本有核细胞数量大于200 000个以保证灵敏度至少为10-4，先检测大量正常骨髓标本建立一个评估的基线，以此为参照，根据CD13、CD34、CD38、CD45、CD117、HLA-DR等抗体的荧光强弱分析是否是LAIPs。Al-Mawali等[8]是在CD45／CD34／CD117的基础上添加不同的淋巴系或髓系抗原以提高检出LAIPs的灵敏度。随着8色、10色流式细胞检测技术的面市，MRD检测的灵敏度和可靠性得到了更大的提高。

4 MRD检测的时机和阳性阈值

MRD的结果不仅应与检测时间点和治疗方法相联系，还应考虑患者的个体因素和疾病特征。目前认为影响预后重要的时间点是诱导治疗后、巩固治疗后、维持治疗后及移植前后。不过，有的研究认为持续动态进行MRD监测更有意义，对于某个确定时间点的MRD，并不能完全反映治疗效果[4]。

定义MRD的阈值主要是为了早期发现高复发风险患者，据此调整治疗策略。Feller等[9]通过多中心的研究推荐MRD的阈值为0.01%，目前国内大多学者对此也比较认同[10]。对高MRD（CR后任何时间点MRD水平大于10-4）患者建议进行强化的缓解后治疗或针对MRD的靶向治疗，对低MRD（CR后所有时间点MRD水平小于10-4）或MRD阴性患者，建议降低治疗强度或缩短治疗时间，以达到人性化、个体化、规范化的治疗策略。

最近国外也有研究将0.15%作为判断预后的阈值，据此将患者划分为复发组和长期生存组，但实验数据显示仍有44%MRD阴性的患者最后复发。相较而言，另有学者认为任何数量的MRD存在均与预后相关，很可能不同的时间点、不同的患者有不同的阈值，这些都由患者本身的分子生物学特性所决定。MRD阈值水平不同，所得到的研究结论亦很难进行统一的评价，这个缺陷将是MFC检测MRD在临床运用中所面临的一个重要挑战[11]。

5 MFC在AML中的运用

在AML患者中，Al-Mawali等[8]运用5色MFC发现：非同步表达往往在相对成熟骨髓细胞中易见（如早期的抗原表型CD34、CD117和相对成熟的标志CD15、CD65共表达），而跨系表达在原始髓细胞中是最常见的LAIPs类型（表达淋巴系标志CD2、CD4、CD5、C7、C10、C19）。

5.1 化疗后的监测 运用MFC检测AML患者的MRD，最有效的方法就是在诊断时识别1个或多个LAIPs，为后续治疗建立一个完善的评价体系。Kern等[12]对58例诱导治疗和62例巩固治疗的AML患者进行了研究，这些患者中LAIPs包括：抗原不同步表达、抗原跨系表达、抗原缺失、抗原过表达。每例患者至少追踪1个LAIPs，从诊断到治疗达CR，LAIPs阳性细胞减少的程度用LD值表示。在巩固治疗组LD值与总生存率（OS）、无复发生存期（RFS）均相关（P＝0.005）；在诱导治疗组LD值只与RFS相关，与OS无关（P＝0.0001）；LD值越大，2年的总生存率（OS）、5年的无病生存（EFS）越高，另外，LD值可作为细胞遗传学的协变量，并认为3个疗程巩固治疗后的MRD水平预后价值更大。无论是在儿童或是成人，MFC监测的MRD与复发密切相关，并且认为MFC更灵敏、可靠。Loken等[13]发现，27例AML患者中有7例没有达到细胞形态学的缓解，这7例患者MFC检测的MRD是阴性的，却相比剩下的20例患者获得更长的生存期。Inaba等[14]发现诱导治疗后大于或等于0.1%MRD复发风险高，预后差，相较于细胞形态学，MFC检测MRD预后的意义更大。

5.2 异基因造血干细胞移植前后的监测 异基因造血干细胞移植已经成为中危、高危患者治疗的重要手段，Bastos-Oreiro等[15]检测了29例AML患者在异基因造血干细胞移植前后MRD的情况，其中18例移植后MRD阴性（LAIPs≤0.1%）比MRD阳性（LAIPs≥0.1%）复发率低（15%vs.66%，P＝0.045）、1年的OS高（83%vs.52%，P＝0.021）。12例移植后MRD阳性的患者，采取了移植后的干预治疗（逐渐减少免疫抑制、供体淋巴细胞输注或二次移植），其中有5例MRD消失，疾病得到了控制，其他7例患者复发。Walter等[16]对99例CR1后行异基因造血干细胞移植的AML患者进行研究，运用10色流式细胞术监测移植前MRD阳性与高复发率相关，并能缩短DFS、OS。Anthias等[17]认为移植前的MRD与疾病复发、诱导治疗失败相关，对于MRD阳性（＞0.1%）的患者，应调整相应的移植策略，例如早期增加GVL效应或移植后预防性的给予供者淋巴细胞输注；而对于MRD阴性的患者则可以适当降低治疗强度。Diez-Campelo等[18]认为在移植后100 d监测MRD意义较大，MRD大于或小于0.1%区分患者的不同风险度。

6 结语

2014年NCCN临床实践指南中提出目前尚无推荐的检测MRD的方法。但根据临床实践发现，MFC和PCR是AML中定量检测MRD最可靠、有效的两种方法，但各有利弊。PCR应用范围窄，检测的靶基因清除慢，不适合早期时间点的检测，多用于巩固和维持治疗后。MFC适用于所有AML亚型的患者，可在早期发现高危患者，及时调整治疗方案，但未来需要明确在什么时间点选用什么方法最有效，如何将MRD定量检测的过程标准化，建立统一的阈值水平，需要实验室与实验室间、实验室和临床医生间加强合作，共同突破这些局限。MRD检测结果不仅应与检测的时间点相联系，还应与患者的年龄、疾病分层、治疗方法相联系，选择有经验的实验室也十分重要，只有综合分析多种影响因素，才能更客观地评价疾病状态，有效地指导制订患者的治疗方案。

最近有研究者使用MFC分析白血病干细胞（Leukemic stem cells，LSCs），LSCs通过自我更新和无限增殖模模拟正常造血作用，产出白血病细胞，化疗虽然能有效杀死白血病细胞，但却不能完全清除白血病干细胞，这些细胞可能导致MRD的持续存在，最终导致复发。与造血干细胞类似，LSCs表达CD34＋／CD38-[19]，体外成瘤实验发现CD123，CD44，CD47可以用以区分LSCs[20]。因此MFC可以用来识别这些潜在的MRD来源，帮助发现潜在的治疗靶点来消除它。

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