钙激活性氯离子通道抑制剂对肺动脉平滑肌作用的研究进展*

潘宣任 综述，王 凯，庞玉生 审校

(广西医科大学第一附属医院儿科，南宁 530021)

·综 述·

钙激活性氯离子通道抑制剂对肺动脉平滑肌作用的研究进展*

潘宣任 综述，王 凯，庞玉生△审校

(广西医科大学第一附属医院儿科，南宁 530021)

钙激活性氯离子通道；肺动脉平滑肌细胞；跨膜蛋白16A

1 肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的钙激活性氯离子通道(CaCCs)与跨膜蛋白16A(TMEM16A)

肺血管张力维持需要CaCCs参与。人们对不同组织(包括肺动脉)中平滑肌细胞上CaCCs进行了广泛研究，发现其通道活性在维持肺血管张力中起着重要作用[1-2]。

CaCCs如何参与平滑肌细胞收缩，现有2 种假设机制[3-4]：(1)“ryanodine 受体(RyR) 通道”机制。肌浆网上的RyR 中，存在Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ) 的特异性磷酸化结合位点，CaMKⅡ能增加兔PASMCs上CaCCs的电流[I(Cl)Ca] 强度[5]。有研究者通过影响Ca2+内流，触发胞内钙池Ca2+释放，引起血管平滑肌收缩。值得注意的是，低浓度ryanodine(1.0 nmol/L～10.0 μmol/L) 可使RyR处于开放状态，但是高浓度ryanodine (0.3～2.0 mmol/L) 反而会使RyR通道关闭[6]。此外，肌浆网表面RyR通道产生的自发瞬时钙释放也可引发I(Cl)Ca。(2)“CaCCs激动剂+三磷酸肌醇受体(IP3R) 通道”机制——CaCCs激动剂有内皮素-1 (ET-1)、5-羟色胺(5-HT)等[7]。膜G 蛋白耦联受体Gq由CaCCs激动剂激活，促使三磷酸肌醇(IP3) 作用于IP3受体通道，导致肌浆网释放Ca2+，CaCCs激活，诱发I(Cl)Ca；另一方面，被激活的CaCCs使细胞膜去极化，电压依赖性钙通道(VDCC)开放，更多Ca2+内流，平滑肌收缩。而PASMCs中的Ca2+浓度在这一正反馈循环中也升高了200～1 000 nmol/L[8]，激活的CaCCs在此过程中起了重要作用。

2008年3个实验室同时发现构成CaCCs的分子基础为TMEM16A,并证实其能编码CaCCs，这使通过基因手段调控CaCCs功能与表达成为了可能，为进一步探究CaCCs生理与生物学特性提供了坚实基础[9-11]。在包括心、肺、肝脏、小肠、胎盘和骨骼肌的人类诸多组织中，TMEM16A mRNA均有分布[12]。Manoury等[13]使用细胞膜片钳技术检测离体的大鼠PASMCs上的生理电流，分离出较强的外向整流性慢激活型I(Cl)Ca，与异源性TMEM16A 通道蛋白中检测到的电流存在高度相似性；另一方面，他们使用小RNA干扰技术将离体培养大鼠PASMCs上TMEM16A的表达下调，发现与之相伴的是全细胞上I(Cl)Ca几乎完全缺失。这说明TMEM16A是大鼠PASMCs上CaCCs蛋白的主要组成部分，对TMEM16A功能与表达的调控完全可以影响PASMCs上CaCCs的功能特性。此发现为与肺动脉相关疾病的研究提供了新平台。

一些肺血管病变，如低氧或高肺血流所致肺动脉高压，都有肺血管收缩异常、结构重塑等病理表现，PASMCs参与了这些病理变化过程，而CaCCs功能异常是其中的重要环节。因此对PASMCs上CaCCs的研究，有助于进一步了解上述疾病形成机制，从而为相关疾病防治找到新思路与新靶点。

2 PASMCs的CaCCs抑制剂

2.1 尼氟灭酸(niflumic acid，NFA) 研究PASMCs上CaCCs，需要对其具有特异性的药物工具，才能从细胞膜上混合生理电流中分离出CaCCs的特定电流，单独完整地证明该通道的生理功能与特性。目前国内研究中，常用于PASMCs的Cl-通道抑制剂有：三苯氧胺(他莫昔芬，tamoxifen，TAM)[14]、NFA和indaryloxyacetic acid(IAA-94)等[15]。其中TAM是一般氯通道阻滞剂[16]，在低氧性肺动脉高压中，莫碧文等[14]发现其抑制PASMCs增生作用与肺动脉血管扩张效应，不仅是通过抑制PASMCs上的CaCCs,也是通过抑制了其上的容量敏感性Cl-通道活性来完成的，因此TAM对于CaCCs不具特异性；而后二者则是常见的CaCCs抑制剂，其中以NFA最具代表性。NFA是一种单羧酸衍生物，曾被认为是CaCCs特异性抑制剂，它能阻滞各种激动剂诱导的血管收缩效应，其浓度在10.0～100.0 μmol/L时，能引起细胞膜超极化和血管舒张，但对胞外高钾介导的收缩效应无影响[8]。杨朝等[17]通过实验证明，NFA可以抑制急性低氧人PASMCs胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)升高，并发现NFA对急性低氧人肺动脉血管环张力具有舒张作用。可能机制是：低氧致[Ca2+]i升高，CaCCs 激活，细胞膜去极化，电压依赖性钙通道开放，胞外大量Ca2+内流，[Ca2+]i进一步升高，平滑肌收缩；NFA抑制CaCCs后，细胞膜去极化作用减弱，胞外Ca2+内流减少，[Ca2+]i降低，平滑肌舒张。另一方面，盛文超等[18]发现，在低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞中，对于CaCCs的通道蛋白mRNA以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，NFA都有着抑制二者表达的作用。前者证明了NFA对肺动脉平滑肌细胞收缩的抑制作用；而对于后者，MAPK通路与细胞增殖、凋亡密切相关，NFA可以负反馈调节[Ca2+]i，阻断MAPK通路激活，抑制平滑肌细胞增殖。但NFA具有双重效应。Ledoux等[19]发现在兔PASMCs上，NFA既能抑制CaCCs，也能刺激出现一个持续的浓度依赖型I(Cl)Ca。在[Ca2+]i为250～500 nmol/L、电压条件为负的情况下，胞外浓度在100.0 μmol/L的NFA可以增强平滑肌细胞的I(Cl)Ca，而外向电流在正电压条件下却受抑制；对NFA洗脱后，正负电压下I(Cl)Ca都增大了。NFA能阻断容积调节性阴离子通道(VRACs)和K+通道，也能影响Ca2+电流，其应用于PASMCs研究将增大解释I(Cl)Ca的复杂性[20]。所以，NFA并非可以完全分离I(Cl)Ca的药理学工具，亦不能成为最理想的研究PASMCs上CaCCs的特异性抑制剂。

2.2 CaCCinh-A01 随着人们对CaCCs研究的深入，近年来国外出现了更具特异性的合成物，其中较新型的药物工具有：CaCCinh-A01[21]和T16Ainh-A01[22]。有研究者在对150种以上红酒进行筛选，发现赤霞珠(一种酿造红葡萄酒的红葡萄品种)的提取物和小分子合成物可以抑制T84细胞的I(Cl)Ca，其半抑制浓度(IC50)是该提取物纯品的1∶200稀释度，而且更高浓度的该药物能产生100%的抑制作用[23]。他们发现给小鼠接种轮状病毒后，再予以口服该药物处理可以阻止腹泻发生。其机制是该药物抑制了上皮细胞CaCCs活性，从而抑制了小鼠肠道上皮细胞液体分泌，此过程中该药物并未影响轮状病毒感染情况。此药物不能阻止霍乱毒素所致水样便的产生，在水样便形成过程中，囊性纤维化Cl-通道(CFTR)(一种cAMP调节性Cl-通道)依赖性液体分泌起到激活机制的作用，这说明该药物并不能抑制肠道上皮CFTR，而只针对CaCCs。此药物即CaCCinh-A01。Yang等[24]以转染了TMEM16A通道蛋白的CHO细胞为研究平台，用以原子吸收光谱技术为基础的检测系统对CaCCs/TMEM16A抑制剂进行了高通量筛选，发现NPPB(一种Ca2+敏感性ICl-抑制剂)和CaCCinh-A01都对CaCCs/TMEM16A具有较好的浓度依赖性效应，二者在浓度为300.0 μmol/L时，都能完全抑制CaCCs/TMEM16A的电流；而CaCCinh-A01的IC50为(6.35±0.27)μmol/L，NPPB的IC50为(39.35±4.72)μmol/L，前者IC50低于后者，说明CaCCinh-A01对CaCCs/TMEM16A电流抑制作用强于NPPB。较早前就有研究认为，3-酰基-2-氨基噻吩类型的CaCCinh-A01是潜在的CaCCs抑制剂[25]，说明其对PASMCs潜在的收缩拮抗作用。但是目前尚未有将其应用于PASMCs中CaCCs的研究。如前所述，TMEM16A是PASMCs上CaCCs的主要成分，而CaCCinh-A01作为CaCCs/TMEM16A电流相对有效的特异抑制剂，将其应用在该方面的研究具有可行性。

2.3 T16Ainh-A01 TMEM16A是CaCCs分子基础的发现，使很多实验课题组将CaCCs特异性抑制剂的研发聚焦其上。有研究者筛选了10万多种化合物，发现小分子抑制剂苯并吡唑类化合物能明显抑制TMEM16A电流，抑制作用较强的A组化合物结构母核为硫代乙酰基连接的嘧啶环与苯并吡唑环，其中抑制作用最强的一种化合物的IC50仅1.0 μmol/L左右，并且其对TMEM16A的Cl-电流抑制并未干扰细胞信号通路上游Ca2+信号[22]，说明该化合物能直接作用于TMEM16A，因此其被命名为T16Ainh-A01。此外，该研究还发现CaCCinh-A01可以完全抑制人气管和小肠细胞上的I(Cl)Ca，而T16Ainh-A01在这些细胞上的抑制作用则相对较弱。研究显示T16Ainh-A01主要抑制的是初始的激动剂刺激性瞬时Cl-电流。Davis等[26]在兔PASMCs上应用了T16Ainh-A01，并以全细胞模式膜片钳技术记录了给药前后以及药物洗脱后细胞膜I(Cl)Ca变化：给药后400 s，标准化电流由原来的1.0下降到0.8以下，而药物洗脱后300 s内电流回升至1.0以上。此前有研究显示，在兔PASMCs全细胞I(Cl)Ca记录中，使用NFA对其具有抑制与刺激的双重效应，刺激效应表现为在负性检验电位时I(Cl)Ca增加，药物洗脱后全细胞电流增强到了给药前水平约200%[5]。而在有的研究者的实验中，无论是给予T16Ainh-A01后，还是药物洗脱后，皆未观察到刺激效应，以10.0 μmol/L浓度给药，5 min后洗脱，全细胞电流恢复到给药前水平(105±5)%。这说明T16Ainh-A01在有效抑制PASMCs上I(Cl)Ca的同时，并未产生过多反向效应，相较于NFA，其将能更真实地反映PASMCs上CaCCs的功能特点。10.0 μmol/L的T16Ainh-A01对阻力性动脉血管有显著抑制性，这些动脉血管上已证明有TMEM16A表达，而且它对于5-HT诱导的大鼠肺动脉收缩亦有拮抗作用[27]，其还对高钾引起的血管收缩无显著影响；它的抑制效能并不受钙激活钾通道阻滞剂(paxilline)、格列苯脲(glibenclamide)或利诺吡啶(linopirdine)影响，上述3种药物分别是ATP敏感性钾通道，KCa3.1、KCNQ编码的钾通道的有效抑制剂，这些通道蛋白也表达在PASMCs中。另外，T16Ainh-A01也同样能拮抗甲氧胺(methoxamine)或U46619诱导的细胞收缩，说明其并非以受体阻断剂的形式来发挥作用的[26]。以上都证明对于PASMCs上的CaCCs，T16Ainh-A01比其他传统CaCCs抑制剂具有更强特异性。

3 总 结

TMEM16A是PASMCs上CaCCs蛋白的主要成分，此发现极大带动了CaCCs特异性抑制剂的研发，较新的药理学工具因而得以出现，而这又推动了CaCCs研究的进一步加深。但运用抑制性药物工具去分析PASMCs上CaCCs功能特点时仍需谨慎，因为相似程度的PASMCs收缩拮抗，也可由直接抑制Ca2+通道或激活K+通道来完成，这都能间接导致具有相同功能的离子通道关闭，从而增加细胞离子通道中生理电流研究的复杂性。另一方面，血管平滑肌上CaCCs是否仅由TMEM16A组成仍具争议，从兔肺动脉上测得天然的CaCCs单通道电导性为1-3 pS[27]，比Yang等[9]在TMEM16A通道蛋白过表达研究中测得的TMEM16A电导性(8 pS)要小，这或许是于表达在血管平滑肌细胞上的不同的TMEM16A剪切变异体具体特性不同所致。因此，对PASMCs上CaCCs完全特异的抑制剂或许尚未出现，仍需大量CaCCs的实验研究去促进更新型CaCCs特异性抑制剂的研发。

CaCCs抑制剂不仅是研究PASMCs上CaCCs较好的药理学工具，其对PASMCs收缩的拮抗作用，也将对人们研发新型血管舒张性药物以防治相关肺动脉高压疾病，提供新的思维与手段。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.035

国家自然科学基金资助项目(81160040)。

：潘宣任(1983-)，硕士，住院医师，主要从事肺动脉高压研究工作。△

，E-mail:pangyush@163.com.cn。

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1671-8348(2015)26-3699-03

2015-03-28

2015-05-12)