萱藻中岩藻聚糖硫酸脂的提取工艺优化及其保肝护肝作用

王庆钧，谷越，杨颖，汪秋宽，宋悦凡，何云海，任丹丹，丛海花

(大连海洋大学食品科学与工程学院，国家海藻加工技术研发分中心，辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁 大连116023)

萱藻Scytosiphon lomentaria隶属于褐藻门，广泛分布于中国辽东半岛到海陵岛之间的沿海地区，属于温带性海藻［1］。萱藻藻体的生长方式为单条丛生，每条长度为15～70 cm，在幼体时藻体为实心，长到成体时变成空心，藻体呈节状，是一种重要的海藻资源［2］。

据报道，萱藻中含有岩藻聚糖硫酸酯［3-5］，岩藻聚糖硫酸酯具有降血脂、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血糖等多种生物活性物质［3-9］。本研究中，采用正交试验法对萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺进行优化，并研究其保肝护肝作用，旨在为萱藻的高效综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜萱藻购自大连市黑石礁市场。清洁级昆明小鼠购自大连医科大学动物实验中心。

纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶均购自上海蓝季科技发展有限公司，山梨醇购自天津市光复精细化工研究所，联苯双酯滴丸购自北京协和药厂。乙醇为95%(体积分数，下同)的食用乙醇，其他试剂均为分析纯。谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT)、乳酸脱氢酶 (LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、微量还原型谷胱甘肽 (GSH)和蛋白定量测试盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1．2．1 萱藻水分的测定参照 GB/T 5009．3—2003［10］，采用直接干燥的方法测定水分含量。

1．2．2 岩藻聚糖硫酸酯提取工艺的优化 准确称取萱藻，加入至萱藻干基18倍的水，用高速组织捣碎机捣碎，使用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶(三者的质量比为4∶3∶2)，在不同的加酶量、酶解时间、pH和酶解温度下进行酶解，然后将其置于沸水中抽提2 h，降至室温后离心，得上清液。在上清液中加入乙醇，至乙醇含量为20%，离心，去掉溶液中的絮状沉淀，得上清液;在该上清液中加入乙醇，至乙醇含量为60%，产生白色沉淀后，离心得到沉淀，即为岩藻聚糖硫酸酯粗产品。将得到的岩藻聚糖硫酸酯粗产品加水溶解，在溶液中加入乙醇至乙醇含量为30%，溶液中产生少许不溶物，离心除去不溶物，得上清液;再加入乙醇，至乙醇含量为70%，溶液中有白色沉淀产生时，用无水乙醚洗涤沉淀，经冷冻干燥得白色粉末即为岩藻聚糖硫酸酯粗提物［11］。

1．2．3 硫酸根和多糖含量的测定 采用盐酸水解-硫酸钡重量法测定硫酸根含量［12］，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量［13］。

1．2．4 岩藻聚糖硫酸酯对四氯化碳 (CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用 将60只体质量为(18±2)g的清洁级雌性昆明小鼠，随机分为6组:空白对照组、CCl4模型组、联苯双酯阳性对照组［剂量为300 mg/(kg·d)］、萱藻岩藻聚糖硫酸酯(F)低剂量组［100 mg/(kg·d)］、F中剂量组［300 mg/(kg·d)］、F高剂量组［500 mg/(kg·d)］，每组放10只小鼠。连续10 d给小鼠饲喂基础饲料，然后对阳性对照组和F剂量组小鼠进行灌胃，每只每天灌胃规定剂量。末次灌胃2 h后，给空白对照组小鼠腹腔注射植物油，给其他5组小鼠按10 mL/kg(体质量)的剂量腹腔注射含0．4%CCl4的植物油溶液［9］。小鼠禁食24 h后，从眼球取血，脱颈处死小鼠，取肝脏称重。血液经3000 r/min离心15 min得到上清，用试剂盒测定AST、ALT、LDH活性。肝脏取相同部位约0．3 g，加入冰生理盐水进行匀浆，配制成10%肝组织匀浆液，剩余的肝脏放入甲醛中浸泡，制成肝切片后用显微镜进行观察。用试剂盒测定肝脏匀浆液中的GSH、MDA、SOD值，并计算肝脏指数:

肝脏指数=肝脏质量 (mg)/体质量 (g)。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示。用 SPSS 17．0软件进行单因素方差分析，用Duncan法进行多重比较，显著性水平设为0．05，极显著性水平为 0．01。

2 结果与分析

2.1 萱藻水分

利用直接干燥法测得新鲜萱藻的水分含量为(90．62±0．003)%。

2.2 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺的优化

在料液比为1∶18(质量比)的萱藻水提取液中，加入纤维素混合酶，以岩藻聚糖硫酸酯的提取率 (提取率=岩藻聚糖硫酸酯/原料干质量×100%)、硫酸根含量为指标，设计4因素3水平的正交试验L9(34)，正交试验设计方案及试验结果见表1和表2。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factor and level table in an orthogonal test factors

表2 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验设计方案及试验结果Tab.2 Orthogonal experimental design and results of the fucoidan extraction from seaweed Cytosiphon Iomentaria

由表2可知，以岩藻聚糖硫酸酯提取率为指标时，由R值得知，各因素的影响能力依次为酶解温度＞酶解时间＞酶加量＞pH，最优组合为A2B2C1D3;以含量为指标时，由R'值得知，各因素的影响能力依次为酶加量＞酶解温度＞酶解时间＞pH，最优组合为A1B1C2D1。

从9组正交试验中得出提取率最优组为8号，即 A3B2C1D3，含量最优组为1号，即A1B1C1D1。试验结果与用极差分析得到的理论值结果不一致，因此，分别对A2B2C1D3、A1B1C2D1和实际的最优组A3B2C1D3、A1B1C1D1进行验证试验，结果见表3。

表3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验验证结果Tab.3 Verification test of the fucoidan extracting in an orthogonal experiment

从表3可见:提取率最高的组为A3B2C1D3，为6．81%，但是在此条件下含量较低;含量最高的组为A1B1C2D1，为27．50%，但是在此条件下提取率不高;综合考虑，A2B2C1D3组的提取率和硫酸根含量都接近最高值，所以确定A2B2C1D3组为最优组。因此，本试验中条件下，确定萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的最佳提取工艺:料液比为1∶18，纤维素酶混合酶酶加量为2．95%，酶解温度为50℃，pH为5．5，酶解时间为60 min，在此条件下，岩藻聚糖硫酸酯的提取率为4．28%，含量为26．04%。

2.3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯对CCl4造成的急性肝损伤小鼠生化指标的影响

2．3．1 小鼠血清中AST、ALT、LDH活性 从表4可见:注射CCl4后，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中AST、ALT和LDH活性均极显著升高(P＜0．01)，说明CCl4对小鼠的肝脏造成了破坏，建模成功;与模型组相比，灌胃岩藻聚糖硫酸酯的各剂量组和联苯双酯阳性组小鼠血清中的AST、ALT和LDH活性均极显著下降 (P＜0．01)，但各剂量组与联苯双脂阳性组之间均无明显差异 (P＞0．05)。

表4 小鼠血清AST、ALT、LDH活性的变化 (n=10)Tab.4 Changes in ALT，AST and LDH activities in mice serum(n=10) U/L

2．3．2 小鼠肝脏中MDA、GSH含量和SOD活性从表5中可见，注射CCl4后，与空白对照组相比，模型组小鼠肝组织中MDA含量和肝脏指数均极显著升高 (P＜0．01)，GSH含量显著降低 (P＜0．05)，SOD活性极显著降低 (P＜0．05)，说明小鼠肝脏遭到破坏，建模成功;与模型组相比，灌胃岩藻聚糖硫酸酯的各剂量组和联苯双酯阳性组的MDA含量和肝脏指数均有降低，除联苯双酯阳性组、F低剂量组与模型组的肝脏指数无显著差异外(P＞0．05)，其余组均与模型组的MDA含量及肝脏指数有显著性差异 (P＜0．05);SOD活性均显著升高 (P＜0．05)，F低剂量组SOD活性的升高效果好于F高剂量组和F中剂量组，GSH含量均有升高，仅联苯双酯阳性组和F高剂量组与模型组有显著性差异 (P＜0．05)。这表明，萱藻岩藻聚糖硫酸酯对小鼠肝脏有显著的保护作用。

综上所述，从萱藻中提取的岩藻聚糖硫酸酯可以抑制脂质过氧化，具有一定抗氧化和清除自由基的能力，可以提高GSH含量和SOD活性，具有显著的保肝护肝作用。

2．3．3 小鼠肝脏的组织学观察 从图1可以看出:空白对照组的肝小叶结构清晰，细胞完整，形态正常，可见清晰的细胞核;CCl4模型组的中央静脉周围细胞出现大面积坏死，细胞破裂成条状，细胞核消失，排列紊乱，说明小鼠肝脏遭到破坏，建模成功;与模型组相比，F低剂量组中央静脉周围的细胞坏死且明显减少，多数细胞完整，形态正常，细胞排列整齐，联苯双酯阳性组和F中剂量组、F高剂量组与空白对照组相近。从光学显微镜下观察到的组织学形态可以得出，萱藻中的岩藻聚糖硫酸酯对CCl4诱导的小鼠肝损伤具有显著的保护作用。

表5 小鼠肝脏MDA、GSH含量和SOD活性的变化 (n=10)Tab.5 Changes in MDA and GSH contents，and SOD activity in livers of a mice(n=10)

图1 光学显微镜 (400×)下CCl4致肝损伤的肝组织切片照片Fig.1 A photomicrograph of(400×)injury liver induced by CCl4under a light microscope

3 讨论

岩藻聚糖硫酸酯存在于海藻细胞的细胞壁基质中，添加的纤维素混合酶主要用于分解细胞壁。萱藻中富含果胶质、蛋白质，在浸提过程中会增加浸提液的黏稠度［14］，使岩藻聚糖硫酸酯不易溶出。针对岩藻聚糖硫酸酯的以上特点，本研究中优化了萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺，得到最优条件为料液比1∶18，纤维素混合酶酶加量为2．95%，酶解温度为 50℃，pH为 5．5，酶解时间为 60 min。在此条件下，岩藻聚糖硫酸酯的提取率为4．28%，含量为26．04%。

本试验中对CCl4造成的急性肝损伤小鼠模型研究结果表明，岩藻聚糖硫酸酯能够显著抑制小鼠血清中ALT、AST、LDH活性的升高以及肝组织中MDA含量、肝脏指数的升高，提高小鼠体内的SOD活性和GSH含量。与模型组相比，F中剂量组、F高剂量组小鼠肝脏指数显著降低，说明岩藻聚糖硫酸酯显著降低了由CCl4造成的急性肝损伤，根据小鼠肝损伤后的肝组织切片也可以得出此结论。

ALT主要存在于细胞浆中，AST主要存在于细胞浆的线粒体中。当细胞受到损伤时，ALT首先进入血液中，当细胞严重损伤危及线粒体时，AST也会进入血液中。LDH是糖酵解过程中一种重要的酶，任何原因引起的肝细胞损伤均可使LDH逸出，引起血清中LDH活力增加。MDA是膜脂过氧化的终产物之一，其含量的高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜脂过氧化，损伤生物膜结构 (主要是细胞质膜)，使得细胞膜结构和功能受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。与模型组相比，F剂量组血清中ALT、AST、LDH活性均显著降低，肝脏中MDA含量显著降低，说明岩藻聚糖硫酸酯显著降低了由CCl4造成的小鼠急性肝损伤中肝细胞的损伤程度，并且降低了肝细胞膜的损伤。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。GSH为解除毒素的特效物质，是一种由三个氨基酸组成的小分子肽，为动物体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂。与模型组相比，F剂量组肝脏中SOD和GSH含量的显著升高，说明岩藻聚糖硫酸酯可能是通过增强小鼠的抗氧化能力，抑制自由基引起的脂质过氧化，从而保护肝脏免受损伤。

综上所述，萱藻中岩藻聚糖硫酸酯具有显著的保护肝脏作用，能显著降低由CCl4造成的急性肝损伤，降低肝细胞和肝细胞膜的损伤程度，作用机理可能是通过增强小鼠的抗氧化能力，抑制自由基引起的脂质过氧化，从而保护肝脏免受损伤。确切的作用机理还有待进一步探明。

［1］李伟新，朱仲嘉，刘凤贤，等．海藻学概论［M］．上海:上海科学技术出版社，1982:148-154．

［2］高伟，宫相忠，张必达．环境因子对萱藻丝状体孢子放散的影响［J］．海洋与湖沼，2012，43(2):244-248．

［3］罗荣珺，李伟．褐藻多糖硫酸酯的研究进展［J］．科技资讯，2011，35:10．

［4］曲桂燕．五种褐藻岩藻聚糖硫酸酯提取纯化及其功能活性的比较研究［D］．青岛:中国海洋大学，2013．

［5］逯慎杰，刘秀河，田宝兰．响应面分析法优化海带提取液制备工艺的研究［J］．食品与发酵科技，2011，47(1):53-64．

［6］孙海森．海带岩藻多糖硫酸酯的分离纯化及相关活性研究［D］．杭州:浙江工商大学，2012．

［7］罗荣君．褐藻多糖硫酸酯的制备及纯化［J］．工业技术，2012，21:83．

［8］王景峰．萱藻岩藻聚糖硫酸酯的制备及其抗血栓活性的研究［D］．青岛:中国海洋大学，2013．

［9］Wang Qiukuan，Song Yuefan，He Yunhai．Structural characterization of alga Costaria costata fucoidan and its effects on CCl4-induced liver injury［J］．Carbohydrate Polymers，2014，107:247-254．

［10］大连轻工业学院．食品分析［M］．北京:中国轻工业出版社，1994．

［11］纪明侯．海藻化学［M］．北京:科学出版社，1997:330-333．

［12］张惠芬，李宝才，范家恒，等．盐酸水解-硫酸钡重量法测定硫酸酯化多糖硫酸基含量方法考察［J］．食品科学，2002，28(5):107-111．

［13］张惟杰．复合多糖生化研究技术［M］．上海:上海科学技术出版社，1987:6-7．

［14］赵前程，滕钊，汪秋宽，等．复合酶法提取海带多糖的研究［J］．沈阳农业大学学报:自然科学版，2007，38(2):220-223．