饲料中高浓度黄曲霉毒素B1在凡纳滨对虾幼虾体内的残留及其影响

李赵嘉，郭冉，曹英昆，夏辉，申亮，魏旭光，王静

(河北农业大学海洋学院，河北秦皇岛066003)

2012年，中国淡水养殖甲壳类产量为234．3万t，对虾产量占69．5%，为162．87万 t，其中，凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei的产量又占对虾产量的38%以上［1］，成为中国重要的水产经济动物之一。随着养殖技术的发展，水产养殖模式也逐渐发生转变，配合饲料投喂的比例越来越大，淀粉和含脂类物质 (如玉米、小麦、花生粕、豆粕和棉粕)又是水产配合饲料生产中所必需的营养物质，这些原料在生产、储存、运输过程中往往因操作不当，加之周围相对较高湿度 (湿度65%以上)和不卫生的环境，极易发生霉变，不仅造成饲料中维生素的降低和脂肪的酸败，更为严重的是可以产生霉菌毒素，水产饲料中植物性组分越大，霉菌毒素含量就越高，对水产动物和食用者健康的危害就越大。黄曲霉毒素B1(AFB1)是霉菌毒素中最有毒的高致癌性化合物［2］，饲料中黄曲霉毒素严重危害水生和陆生动物的健康已引起了生产者和养殖者的广泛关注。

甲壳动物体内存在一种类似于脊椎动物的补体级联系统——酚氧化酶原激活系统 (proPO系统)，在免疫识别和防御中起着关键作用［3-4］。proPO系统中的因子以非活化状态存在于血细胞中［5-6］，当受到外源刺激后释放到血淋巴中［7-8］，在酚氧化酶原激活酶的刺激下变为有活性的酚氧化酶 (PO)，并以多种方式参与宿主细胞的防御反应。国内外已有学者对对虾的酚氧化酶活力进行了研究，但是，关于AFB1入侵凡纳滨对虾体后，所引起的血淋巴中PO的特性却鲜有研究。为此，本试验在总结前人研究成果的基础之上，探究了AFB1对凡纳滨对虾血淋巴中PO变化的影响。

王静等［9］报道，随着饲料中 AFB1浓度的升高，凡纳滨对虾肝胰腺中AFB1的残留量逐渐增加，2000 μg/kg AFB1浓度组中的残留量最高(95．49 μg/kg)，因此，AFB1可在水产生物体内(甚至可食用组织)富集［10］;Han 等［11］研究发现，异育银鲫Carassius auratus gibelio饲料中AFB1浓度为9．55～28．60 μg/kg时，饲喂3个月后异育银鲫肌肉中可检测出2．00～4．08 μg/kg的AFB1;同时黄曲霉毒素M1(AFM1)作为AFB1在组织中的主要代谢产物，其毒性主要表现为致癌性和致突变性，破坏人及动物的肝脏并导致肝癌甚至死亡，不同动物组织以牛奶最容易出现AFM1的残留量［12］，对消费者的健康构成了潜在的危害，因此，检测养殖动物不同组织中AFB1、AFM1的残留量很有必要。

Munoz等［13］研究显示，测定肝胰腺中超氧化物歧化酶 (SOD)的活性可以反映出AFB1对动物机体抗氧化能力的影响，SOD的催化作用可消除超氧阴离子自由基，阻碍自由基对正常细胞的氧化伤害，因此，SOD的活力间接反应了机体清除氧自由基的能力。测定SOD的活性，在一定程度上反映出饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺的影响程度，以期探讨AFB1对水生甲壳动物的毒性作用机制，可以为凡纳滨对虾的生态养殖及水产品安全提供参考。

本试验以王静等［9］的研究为基础，选择一组死亡率不高且浓度较高的AFB1(1600 μg/kg)饲料作为试验饲料，进一步观察了高浓度黄曲霉毒素在对虾免疫代谢过程中对其代谢生化指标的影响，进而为生产实践中预防并减缓黄曲霉毒素对对虾的毒害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

凡纳滨对虾虾苗购于河北沧州黄骅鑫海生物技术公司，体质量为 (0．30±0．02)g。选取长势良好、体质健壮的凡纳滨对虾虾苗放入实验室水族箱内，投喂配合饲料，暂养10 d后进行试验。

AFB1标准品购买于Sigma公司。

1.2 方法

1．2．1 试验饲料的制备 为排除原料中其他霉菌毒素对试验结果的影响，本试验中采用纯化饲料，即将纯化的粉末状黄曲霉毒素B1标准品与原料充分混合。基础饲料配方 (均为质量分数)为:酪蛋37．0%、明胶9．2%、维生素20．7%、玉米淀粉20%、鱼油 3．5%、玉米油 3．5%、大豆磷脂0．5%、复合矿物盐0．5%、复合维生素2．0%、氯化胆碱 (50%)0．5%、VC磷酸酯0．5%、甜菜碱0．1%、CMC 2．0%，基础饲料营养成分见表1。将所有原料经过粉碎机 (山东精诚机械制造有限公司，WKF-60型)粉碎，再依次过80目网筛，按基础饲料配方将原料按比例混合均匀，加入鱼油后手工将形成的小颗粒搓散并置于搅拌机 (北京环亚天元机械有限公司，HYJ-30型)中搅拌，边搅拌边加入30%左右的蒸馏水，成团后于双螺杆压条机［华中理工大学监制，F-26(Ⅱ)］中挤压呈直径1．5 mm的条状饲料，在60℃烘箱中熟化4 h后晾干，装入密封袋中于冰柜 (-20℃)中保存备用。

1．2．2 饲养管理 将幼虾在实验室内40 cm×50 cm×60 cm的玻璃水箱中饲养8周，每箱放虾100尾，试验组投喂含有AFB1(1600 μg/kg)的饲料，对照组投喂不含黄曲霉毒素的基础饲料，每组设3个平行，共计6箱。投喂量为虾质量的6%～7%，每天7:00、12:00、17:00投喂，用虹吸法清除粪便后更换1/3海水，及时巡查各箱，拣出死虾，并测定其体长和体质量。养殖用水为经过滤、消毒的天然海水，盐度为30，连续充气，用电加热棒维持适宜水温。每天记录水温，每两周测定一次养殖海水中的溶氧、pH、总氨氮含量。试验期间，水温保持在 (28．06±0．09)℃，溶氧为 (7．26±0．6)mg/L，pH 为 7．3 ～ 7．7，总氨氮为 (1．4 ±0．3)mg/L。

表1 基础饲料的营养成分Tab.1 Approximate composition of the basic diet w/%

1．2．3 样品的采集 试验结束时，禁食24 h后，从每箱随机取5尾幼虾，分别取血淋巴及肌肉、肝胰腺、肠道组织样品。使用1 mL一次性无菌注射器自虾头胸甲后缘围心腔内3 mm左右抽取血淋巴。抽取前，注射器中预先吸入0．2 mL改进后的预冷凡纳滨对虾血淋巴抗凝剂［4，14］(0．01 mol/L EDTA-Na2，0．34 mol/L NaCl，0．01 mol/L KCl，0．01mol/L HEPES， pH 7．45， 渗 透 压 780 mOsm/kg)，最终按血淋巴与抗凝剂3∶2的比例置于离心管中，4℃下在1000 g冷冻离心机中离心，取其淡蓝色上清待测。在研磨器中加入缓冲溶液置于冰水浴环境中，将肝胰腺组织研磨充分后置于离心管中，于冷冻离心机中离心得上清液。将所得样品均保存于超低温冰箱 (-80℃)中待测。

另外，从每箱再随机取1尾幼虾的完整肝胰腺(外有包膜)，放入事先准备好的体积分数为4%的中性甲醛固定液中固定，以备制作H．E［15］染色切片。

1．2．4 指标的测定 使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定幼虾组织中AFB1、AFM1的残留量，试剂盒购于上海佑隆生物科技公司。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛 (MDA)含量，采用化学荧光法测定活性氧 (ROS)含量，以每毫克蛋白的荧光强度表示。上述指标的测定均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。

酚氧化酶 (PO)作为体液免疫的第一道防线，本研究中对PO活力的瞬时值进行了测定。饲喂AFB1后，3～5 h之内完成取样，测定幼虾血淋巴细胞在受到外源物刺激后PO酶释放到血清中随时间的瞬时变化，观测细胞的免疫启动和应答状况。

PO活力的测定参考Ashida的方法，以LDOPA为底物，取 10 μL 血淋巴，加入 200 μL 0．1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液 (pH 6)，再加入10 μL 0．01 mol/L的L-DOPA，于室温下混匀，每4 min读取一次490 nm处的吸光度 (OD)，另取10 μL蒸馏水以代替血淋巴样品，于490 nm波长下测得吸光度为OD1，以10 μL蒸馏水代替底物L-DOPA，在490 nm处测得吸光度为 OD2。每分钟OD490nm值增加0．001为一个酶活力单位 (U)，PO活力的计算公式为

1.3 数据处理

试验数据用平均值 ±标准误 (mean±S．E．)表示，使用SPSS 17．0软件进行单因子方差分析(One-way ANOVA)，若差异显著，再采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0．05。

2 结果与分析

2.1 AFB1和AFM1在虾体内的残留量

从表2可见，凡纳滨对虾幼虾摄食含高浓度AFB1饲料8周后，肝胰腺中AFB1残留量为2．18 μg/kg，肌肉中未检测到残留量，肠道中有少量残留量被检测出，为0．11 μg/kg。由此可见，当幼虾持续摄入高浓度AFB1时，肝胰腺中残留量高于肠道残留量，肌肉中未检测出残留量。肝胰腺中AFM1的残留量 (0．32 μg/kg)高于肠道残留量(0．05 μg/kg)，肌肉中同样无AFM1残留量检出。

多重比较结果表明，肝胰腺中AFB1、AFM1的残留量均显著高于肠道残留量 (P＜0．05)。

表2 AFB1、AFM1在凡纳滨对虾幼虾肝胰腺、肌肉、肠道中的残留量Tab.2 Residues of AFB1and AFM1in hepatopancreas，muscle and gut of juvenile Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei μg/kg(样品)

2.2 凡纳滨对虾免疫指标的变化

从表3可见:试验结束时，试验组幼虾肝胰腺中的SOD活性显著低于对照组 (P＜0．05)，MDA含量显著高于对照组 (P＜0．05);试验组幼虾血淋巴中的SOD活性低于对照组，MDA含量则高于对照组，但均无显著性差异 (P＞0．05);试验组肝胰腺中ROS含量显著高于对照组 (P＜0．05)。

2.3 凡纳滨对虾PO活力的变化

凡纳滨对虾幼虾血淋巴中PO活力随时间的变化见图1。从图1可见，随着时间的延长PO活力不断升高，在4～28 min时，试验组PO活力的增PO活力显著高于对照组 (P＜0．05)。

图1 酚氧化酶活力随时间的变化Fig.1 Changes in PO activity with the time

2.4 凡纳滨对虾肝小管结构的变化

试验结束时，试验组和对照组凡纳滨对虾幼虾肝胰腺的显微结构如图2所示。

摄食含高浓度AFB1饲料的幼虾肝胰腺颜色呈灰白色，结构和形状正常;随着时间的推移，肝胰腺严重肿大，触之即碎;第8周时靠近消化道处的肝胰腺细胞受损严重，肝胰腺细胞紧缩，出现大面积的空泡区 (图2-F)，逐渐向肝胰腺边缘扩散，很难找到完整的柱状细胞，食道周围肝细胞消失，严重的仅残留肝小管，甚至肝小管消失。

表3 AFB1对凡纳滨对虾幼虾免疫指标和酚氧化酶活力的影响 (n=3)Tab.3 Effects of dietary aflatoxin B1on immune index and PO activity in juvenile Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

图2 饲料中AFB1对凡纳滨对虾幼虾肝胰腺显微结构的影响Fig.2 Microstructure of hepatopancreas in juvenile Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei fed the diet containing AFB1

3 讨论

3.1 凡纳滨对虾组织中AFB1、AFM1的残留量

El-Sayed 等［16］研究发现，用含 18 μg/kg AFB1的饲料饲喂海鲈Perca fluviatilis 6周后，海鲈肌肉中的残留量可达 4．25 μg/kg。Huang 等［17］研究发现，摄食含低浓度的AFB1饲料后，银鲫Carassius auratus gibelio肌肉中有少量AFB1残留，而肝脏中AFB1残留量则超过5 μg/kg。本试验中，饲喂含高浓度的AFB1(1600 μg/kg)饲料8周后，幼虾肝胰腺中残留量为2．18 μg/kg，肠道中的残留量为0．11 μg/kg，而肌肉中几乎没有 AFB1残留，与对鱼类的研究结果不同。许万祥［18］用污染量为25～2500 μg/kg的AFB1日粮饲喂成年的斑节对虾Penaeus monodon，对其肝胰腺和触角腺切片观察发现，有病理组织学改变，但并没有在对虾其他组织中检测到毒素的存在。

当对虾摄入AFB1后，在肝胰腺中代谢产生AFM1，但是关于AFM1在对虾组织中残留量的检测却鲜有报道。高领等［12］指出，荷斯坦乳牛Holstein dairy cow摄食含有AFB1的饲料7 d后，可在其乳汁中检测出 AFM1，但是停喂4 d后乳汁中AFM1消失。本试验中，也检测了对虾肝胰腺、肠道和肌肉中的AFM1残留量，检测出肝胰腺中AFM1的残留量为0．32 μg/kg，肠道中为 0．05 μg/kg，而肌肉中几乎没有AFM1残留，说明AFB1的代谢主要在肝胰腺中，排泄时有极小的一部分在肠道中吸收，肌肉中则不存在AFM1残留。

3.2 AFB1对凡纳滨对虾代谢生化指标的影响

血液成分作为病理、生理和毒理学的重要指标，其变化往往可作为虾类营养和健康状况分析的依据，虾体的病理或生理变化，在血液指标上必定会反映出来［19］。张健等［20］研究指出，PO 通过氧化酚生成醌，最终产生黑色素，是对虾免疫过程中产生的重要高活性物质，其中间产物具有抑制异己物胞外蛋白酶和几丁质酶活性的作用，能有效抑制甚至杀死异源物，能促进对虾包裹、结节和修复等免疫活动，提高对虾机体的免疫力。PO还可以作为调理素，具有促进血细胞的吞噬作用［21］。本试验中，试验组PO酶活性显著高于对照组，增长趋势也大于对照组。饲料中AFB1进入虾体后属于异源物质，必定会激活机体的非特异性免疫系统来阻止异源物质对机体的入侵。

AFB1的毒性与其代谢方式和途径密切相关。当AFB1进入体内，往往是有氧代谢，不可避免地会产生有氧自由基 (ROS)［22］，攻击周围的生物分子，使酶蛋白失活、DNA断裂等，若不能及时清除，最终可导致组织细胞凋亡、免疫功能下降，甚至死亡［23］。解毒代谢主要发生在肝细胞微粒体内，SOD作为机体内抗氧化、清除自由基最为主要的酶类，在终止自由基连锁反应，使其维持在一个较低水平的平衡状态方面有极其重要的作用。SOD活力的高低可以间接地评价机体细胞氧化受损程度和活力氧水平，在判断机体健康状况和免疫机能等方面有重要的参考价值［24］。水产动物组织中高度不饱和脂肪酸含量高于其他动物，受到氧自由基攻击后更容易发生脂质过氧化反应，将活性氧转化成活性化学物质 (如醇类、醛类、烃类)，使机体处于氧化胁迫状态，并通过链式或链式支链反应而放大［25］。MDA为脂质过氧化作用的主要产物，如果超出正常范围便会毒害细胞，使代谢功能出现障碍甚至使细胞凋亡，因此，MDA含量的高低，可以间接了解机体细胞脂质氧化程度以及组织细胞受氧化损伤的程度［26］。本研究中，试验组肝胰腺中ROS和MDA含量显著高于对照组 (P＜0．05)，而试验组SOD活性显著低于对照组 (P＜0．05)，肝胰腺中MDA含量与SOD活性呈负相关，说明当机体脂质过氧化水平升高时，肝胰腺细胞抗氧化与清除自由基的能力随饲料中AFB1的出现而减弱;试验组对虾血淋巴中MDA含量较对照组高，而SOD活性则低于对照组，但均不存在显著性差异 (P＞0．05)，表明AFB1使脂质过氧化程度增加，机体氧化损伤增大。虽然血淋巴中不存在显著性差异，但从肝胰腺指标中可以判定出试验虾的肝胰腺受到严重损伤，肝胰腺中超氧自由基含量高，肝胰腺受损严重且自主修复能力显著下降。Bintvihok等［27］仅进行了10 d试验后就发现，AFB1的质量浓度低于20 μg/kg的饲料就足以损害对虾肝胰腺的机能，改变血淋巴正常的生化指标。

3.3 AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺显微结构的影响

Santacroce等［28］研究指出，AFB1能诱发肝脏机能紊乱，组织病变，表现为肝脏器官水肿，炎症细胞增多，肝细胞空泡化严重。Radhika等［29］研究表明，这种改变主要表现为肝脏细胞和肝小管形成结节、细胞伸长、间质纤维化、坏死或血淋巴细胞浸润。Ostrowski-Meissner等［30］研究发现，受AFB1污染，对虾的肝胰腺边缘肝小管细胞坏死及病灶细胞变性。本试验中，通过切片观察发现，当饲喂含有高浓度AFB1的饲料后，凡纳滨对虾肝胰腺细胞受损，近消化道严重，逐渐向肝胰腺边缘扩散。损伤表现为:肝胰腺细胞紧缩，出现大面积空泡区，很难找到完整的柱状细胞，食道周围肝细胞消失，严重的仅残留肝小管，甚至肝小管消失。Boonyaratpalin等［31］曾报道，饲喂斑节对虾Penaeus monodon含100～2500 μg/kg AFB1的饲料后，先是肝胰腺中的肝细胞萎缩，随后肝小管上皮细胞坏死，基本与本试验结果吻合。

综上所述，黄曲霉毒素在虾饲料中的毒性及其对对虾的危害主要是通过降低细胞抗氧化能力和细胞修复能力，导致肝胰腺细胞不可逆损伤和组织病变。长时间饲喂含AFB1的饲料可增加其在虾体内的富集，对水产品安全以及消费者的身体健康是一个极大的隐患，因此，明确AFB1在对虾养殖业中产生的危害，防控霉菌毒素将成为能否解决饲料和水产品安全的重要问题，对整个对虾产业具有重要的意义。

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