利用Cytb和16S rRNA序列研究多鳞四指马鲅和四指马鲅的种群遗传结构

徐志进，章霞，柳敏海，傅荣兵，李伟业，油九菊

(舟山市水产研究所，浙江舟山316000)

多鳞四指马鲅Eleutheronema rhadinum和四指马鲅E．tetradactylum是广泛分布于印度洋和太平洋西部的经济鱼类品种，两者同属于鲻形目Mugiliformes、马鲅科Polynemidae、四指马鲅属Eleutheronema［1］，中国沿海均产之，以南方为多［2-4］，俗称章跳、马友、午鱼、牛笋、祭鱼、鲤后。四指马鲅生长快、肉质鲜、营养丰富，深受广大消费者喜爱。近年来，随着四指马鲅人工育苗技术的推广［5］，四指马鲅的人工养殖已逐步形成规模。

目前，国内对四指马鲅属鱼类的认识存在概念混乱的现象，常将多鳞四指马鲅误鉴为同属的四指马鲅。关于这两种鱼类的鉴定以及遗传多样性差异方面的研究报道不多，仅见 Motomura［6］在对其形态学研究时指出，两种鱼类在有无犁骨齿板、胸鳍颜色、侧线鳞数目等有明显的区别，可作为其分类依据，而在其他相关的研究中只见对单一物种的遗传差异或者系统发育的研究。林少珍等［7］基于COI序列分析了东海四指马鲅的种群遗传结构，杨阳等［8］研究了多鳞四指马鲅4个地理群体的形态差异，常有民等［9］观察了多鳞四指马鲅耳石形态特征，但关于两者之间的遗传差异和种群结构的研究目前仍属空白，亟待科学研究后填补。

细胞色素b基因 (Cytb)和16S rRNA基因作为常用的线粒DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)分子标记，适用于种群以及种间遗传多样性的分析［10-14］，能够有效应用于鱼类分类和系统进化研究，帮助监管渔业资源和维护海洋生物的生物多样性。本研究中，克隆并分析了来自江苏海域多鳞四指马鲅和台湾四指马鲅两个群体的Cytb和16S rRNA基因片段，并探讨了两者的种群遗传结构及种间是否存在较大的遗传差异，以期为中国四指马鲅的遗传多样性研究提供参考数据，同时还探讨了能否在分子水平上鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅，旨在合理保护和开发中国的鱼类资源，以及为四指马鲅属鱼类的鉴别提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

多鳞四指马鲅取自江苏 (JS)，四指马鲅取自台湾 (TW)，各取30尾样品的尾鳍固定于体积分数为95%的酒精中。

1.2 方法

1．2．1 鱼类总DNA的提取 取两种样品鱼鳍条30 mg左右，用酚氯仿法提取鱼类总DNA［15］，于超低温冰箱 (-80℃)中保存备用。

1．2．2 PCR扩增及序列测定 16S rRNA和Cytb基因片段的扩增引物由上海生工公司合成，引物序列［16］为

反应体系 (共 50 μL):10 × Buffer 5．0 μL，200 mmol/μL dNTPs 1 μL，10 μmol/L双向引物各2 μL，50 U/μL Taq 酶 0．1 μL，100 ng/μL DNA 模板约2 μL，用灭菌超纯水补足至50 μL。PCR反应条件:94℃下预变性5 min;94℃下变性30 s，55℃下退火1 min，72℃下延伸40 s，共进行40个循环;最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存。PCR扩增产物采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，由生工生物工程 (上海)股份有限公司完成PCR产物的测序。

1.3 数据处理

测得的序列先在NCBI网站上进行比对，确定为目的序列，再采用 ClustalX 1．81软件进行比对［17］。用 MEGA 5．0 软件［18］分析与计算序列特征、变异位点、遗传差异和遗传距离等，并采用NJ法 (Neighbor-joining)构建系统发育树，通过DNASP 4．0软件进行单倍型多样性、核苷酸多样性、平均碱基差异的计算［19］。选择 Arlequin 3．01中的AMOVA进行分析，用Tajima'SD和Fu'S Fs中性检验评估其种群结构与种群动态［20］。

2 结果与分析

2.1 两个四指马鲅群体的Cytb和16S rRNA序列分析

通过克隆并测序获得多鳞四指马鲅和四指马鲅的各60条Cytb同源核苷酸序列 (长度约为394 bp)和16S rRNA同源序列 (长度约为561 bp)。在两种序列的碱基组成中，A+T含量分别为51．6% ～55．8%(Cytb)和 51．6% ～52．4%(16S rRNA)，均高于G+C含量 (表1)，并且两个四指马鲅群体16S rRNA和Cytb序列的碱基组成相似，无明显差异。

60条16S rRNA碱基序列中存在2个单倍型，其中不包含简约信息位点和单一位点，江苏多鳞四指马鲅 (JS群体)与台湾四指马鲅 (TW群体)的16S rRNA序列相比较有5个碱基缺失，两个群体各自共享有1个16S rRNA单倍型 (图1)。60条Cytb核苷酸序列中存在4种单倍型，其中包含1个简约信息位点和2个单一位点，在JS群体中存在3个单倍型，TW群体存在1个单倍型 (图2)，基于Cytb和16S rRNA序列的两个四指马鲅群体的单倍型多样性和核苷酸多样性分析如表2所示。

表1 两个四指马鲅群体Cytb和16S rRNA核苷酸序列的碱基组成Tab.1 Base pair composition of Cytb and 16S rRNA sequences in two Eleutheronema species

2.2 两个四指马鲅群体的种群遗传结构及遗传多样性

根据16S rRNA核苷酸序列，分析得到两个四指马鲅群体的遗传距离为0．114。而基于Cytb核苷酸序列各单倍型的遗传距离如表3所示，江苏多鳞四指马鲅群内遗传距离为0．003～0．008，平均遗传距离为 0．005。

采用邻接法构建两个四指马鲅群体Cytb核苷酸序列的系统进化树如图3所示。结果表明，两个群体的单倍型各自聚为一支，针对江苏多鳞四指马鲅Cytb单倍型的 Tajima'SD检验结果为-0．529 39，P ＞ 0．1，Fu'S Fs中性检验结果为-1．030 1，P＞0．1，差异均不显著，表明江苏多鳞四指马鲅群体未经历过种群的扩张。

图1 江苏多鳞四指马鲅 (JS)和台湾四指马鲅 (TW)的16S rRNA核苷酸序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of partial 16S rRNA sequence between Jiangsu E.rhadinum and Taiwan E.tetradactylum

图2 江苏多鳞四指马鲅 (JS)和台湾四指马鲅 (TW)的Cytb核苷酸序列比对Fig.2 Pairwise alignment of partial Cytb nucleotide sequence between Jiangsu E.rhadinum and Taiwan E.tetradactylum

表2 基于Cytb和16S rRNA(括号中)序列的两个四指马鲅群体遗传多样性数据分析Tab.2 Data analysis of genetic diversity between two Eleutheronema species based on Cytb and 16S rRNA sequences in parentheses

表3 基于Cytb核苷酸序列的两个四指马鲅群体遗传距离Tab.3 Genetic distances of Cytb nucleotide sequences between two Eleutheronema species

图3 基于Cytb核苷酸序列的两个四指马鲅群体的NJ系统发生树Fig.3 Phylogenetic tree of two Eleutheronema species based on Cytb nucleotide sequence

3 讨论

3.1 江苏多磷四指马鲅和台湾四指马鲅Cytb与16S rRNA的序列特征

两个四指马鲅群体的Cytb与16S rRNA序列中G+C含量均低于A+T含量，Cytb核苷酸序列的G含量低于其他3种碱基，平均为16．16%。说明这个基因密码子的碱基使用存在偏向性，这与白鲑Coregonusclupeaformis［21］、 赤 眼 鳟 Spualiobarbus Curriculus［22］、石斑鱼 Epinephelussp［23］、灰鲳 Pampus nozawae［23］、罗非鱼 Oreochromis［24］、鳕 Macrobrachium［25］和其他脊椎动物的结构相似。同时，通过比较发现，这两个四指马鲅群体的Cytb序列所体现的遗传差异均大于16S rRNA序列，表明在这2种四指马鲅属中Cytb序列较16S rRNA序列的碱基变异大、进化快，更适用于种及以上等级之间的遗传学研究［26］，这也符合其他鱼类种群遗传多样性和种间分析的研究结果［27-30］。

3.2 江苏多鳞四指马鲅和台湾四指马鲅的遗传多样性分析

核苷酸多样性反映了位点在群体中的多样性状况，是反映种群遗传多样性的重要指标。基于Cytb序列的核苷酸多样性，多鳞四指马鲅为0．001 98，四指马鲅为0;基于16S rRNA序列的核苷酸多样性两者均为0，均远低于其他鱼类。基于2个基因片段的单倍型多样性研究表明，只有多鳞四指马鲅 Cytb的单倍型多样性为 0．582(H＞0．5)，而核苷酸多样性水平较低，表明其种群数量可能曾经下降［31］。Fu'S Fs中性检验、歧点分布分析能有效体现种群动态发展形式［23］。江苏多鳞四指马鲅鱼类的中性检验结果为负值 (-1．030 1)，无显著性差异(P＞0．1)，表明这种鱼类未经历种群的扩张。

3.3 江苏多鳞四指马鲅和台湾四指马鲅的分子学鉴定

不同种鱼类的区分通常靠生物形态学和遗传学分析方法进行鉴别，其中形态学就是根据肉眼可见的鱼类外部形态特征来进行鉴定，适用于区分完整个体的种类［25］，这就要求水产相关人员具有较好的分类学基础。但针对多鳞四指马鲅和四指马鲅形态相似度极高的情况，大多数从业人员易于混淆或者忽略，这就需要运用遗传学分析来作为区别这两类鱼的重要手段。本试验结果表明，可通过Cytb、16S rRNA核苷酸序列分析鉴别这两种四指马鲅属鱼类，这为两种鱼类的增殖、产品加工等生产应用，以及鱼种种群的遗传多样性保护提供了重要依据。

本研究中发现，四指马鲅属的这两种鱼类群体遗传多样性水平偏低，这符合Horne等［32］、林少珍等［7］的研究结论。Horne等［32］指出，澳大利亚北部四指马鲅鱼类的种群遗传结构存在区域性，四指马鲅之间的基因交流主要靠自我补充和偶然变异，这可能与四指马鲅幼鱼的游泳能力弱和方向感不强有关;而林少珍等［7］推测，东海四指马鲅鱼类的遗传多样性偏低可能是由水环境恶化以及过度捕捞、补充群体不足等原因造成的。鉴于目前的研究内容和研究方法比较薄弱，有必要进行多海域的四指马鲅取样研究，并丰富研究手段，以期获得更加全面、谨慎、科学的研究结果。同时，也有必要及时采取适当的管理策略，减少海域捕捞的次数，控制渔获量，恢复四指马鲅鱼类的野生资源，保护鱼类资源的生态平衡。

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