桃蚜对噻虫嗪代谢抗性机制研究

张平艳， 周小毛

（湖南农业大学农药研究所，长沙 410128）

桃蚜对噻虫嗪代谢抗性机制研究

张平艳， 周小毛*

（湖南农业大学农药研究所，长沙 410128）

对桃蚜进行室内噻虫嗪抗性品系筛选，选育至15代后抗性倍数达到75.6倍。对噻虫嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）桃蚜的谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、酸性磷酸酯酶（ACP）、碱性磷酸酯酶（ALP）、羧酸酯酶（CarE）、多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基活性进行了比较，结果显示：敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）的谷胱甘肽S-转移酶比活力分别为3.127 5和3.215 9，差异不显著，桃蚜抗性品系体内酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶O-脱甲基活性均显著高于敏感品系，分别达到了1.57、2.10、6.12、2.03倍。表明桃蚜对噻虫嗪抗性的产生与酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶O-脱甲基的活性相关。

桃蚜； 噻虫嗪； 抗药性； 解毒酶系

桃蚜［Myzus persicae（Sulzer）］又名烟蚜，属同翅目蚜科，是多食性害虫，寄主范围广，主要取食十字花科、菊科、茄科、豆科等50个科中的大约400多种植物［1］，同时也是植物病毒病的传播媒介［2-3］。一直以来在桃蚜为害地区主要是使用化学农药进行防治，杀虫剂持续和高剂量的使用致使桃蚜对多种杀虫剂产生了不同水平的抗药性［4-7］，其中包括新一代硫代烟碱类杀虫剂噻虫嗪。噻虫嗪是一种全新结构的第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，对害虫具有胃毒、触杀及内吸活性，用于叶面喷雾及土壤灌根处理。其施药后迅速被根系内吸，并传导到植株各部位，对刺吸式害虫如蚜虫、飞虱、叶蝉、粉虱等有良好的防效。有报道发现桃蚜对烟碱类杀虫剂容易产生抗药性［8］。

昆虫体内多种代谢酶系对昆虫产生抗药性起着重要作用。磷酸酯酶是昆虫体内重要的水解酶，主要可分为酸性磷酸酯酶（ACP）和碱性磷酸酯酶（ALP）两种，酯酶对进入昆虫体内的外源有毒物质起解毒代谢作用，同时也影响着害虫抗药性的产生［9］。羧酸酯酶是昆虫抵御外源有毒物质的一种重要物质，在对杀虫剂抗性中起着重要的作用，可以使昆虫产生代谢抗性［10］。谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内的重要解毒代谢酶系，其与多种解毒机制密切相关［11］。多功能氧化酶（MFO）主要对有毒物质进行氧化代谢，其底物谱极广，与许多害虫的抗药性产生相关［9，12］。本研究在室内筛选得到桃蚜噻虫嗪抗性品系的基础上，比较了桃蚜抗性和敏感品系4种解毒酶的活性差异，探讨桃蚜对噻虫嗪抗性形成的生理生化机制，旨在为防治桃蚜时合理使用杀虫剂及抗性治理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

敏感品系：桃蚜（Myzus persicae）敏感品系于2006年10月采自湖南郴州市安仁县熊蜂山自然保护区一野生桃树上，该区域为自然保护区，方圆10 km内从未使用过化学农药。室内使用自种萝卜苗继代饲养桃蚜（光照培养箱设定温度为（25±1）℃，光周期L∥D＝16 h∥8 h，相对湿度70%～80%），作为噻虫嗪相对敏感品系（THI-S）。

抗性品系：将采回的相对敏感品系用25%噻虫嗪水分散粒剂汰选得到。根据毒力测定结果，用25%噻虫嗪水分散粒剂配制好LC70浓度的药液置于烧杯中，烧杯中放入适量棉花，将萝卜苗茎浸入上述烧杯中24 h后饲养桃蚜，饲养1 d后将存活桃蚜用毛笔挑至新种萝卜苗上饲养，采用此方法进行继代饲养和汰选，每次处理浓度控制在杀死70%左右成蚜，根据生测结果适当提高用药浓度，每代进行一次毒力测定。以几率值法计算毒力方程，LC50及95%置信区间。经过对桃蚜相对敏感品系15代汰选后得到桃蚜相对抗性品系（THI-R）。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 供试药剂

98%噻虫嗪（thiamethoxam）原药（瑞士先正达作物保护有限公司），用于生物测定试验；25%噻虫嗪水分散粒剂（瑞士先正达作物保护有限公司），用于抗性筛选。

1.2.2 主要试剂

乙酸-α-萘酯、乙酸-β-萘酯、对α-萘酚、还原型L-谷胱甘肽（GSH）、对硝基苯和NADPH均为Sigma公司产品；硝基苯酚（NO2C6H4OH），上海三爱思试剂有限公司；对硝基磷酸二钠（C6H4NNa2O6P· 6H2O），Merck公司；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），北京鼎国生物技术有限公司；对硝基苯甲醚（C7H7NO3），上海三爱思试剂有限公司；牛血清白蛋白Albumin，上海伯奥生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250，Fluka公司。本试验提取和酶学测定部分所用试剂为分析纯试剂。

1.2.3 主要仪器

UV-2201型紫外分光光度计，日本岛津公司，Beckman低温离心机，德国贝克曼公司。

1.3 萝卜苗种植方法

将萝卜种子浸泡水中5 h后再使用75%百菌清500倍液浸泡0.5 h，种子用清水冲洗干净后均匀种植在未含农药的湿润土壤中，置于光照培养箱中，培养温度为（25±1）℃，相对湿度55%，光周期L∥D＝16 h∥8 h，每3～5 d种植一批萝卜苗。

1.4 生物测定方法

采用叶柄内吸法，将花椰菜（Brassica oleraceavar.botrytisLinn.）叶剪下后立即将叶柄浸入系列浓度药液（0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/L）中，24 h后将带药叶片剪取d＝5.5 cm的圆片，先向培养皿中倒入12 g/L的琼脂3～5 mm用以保湿，待琼脂冷却后将叶片放置在d＝6 cm的培养皿内，每个培养皿中放入30头大小一致的桃蚜，用保鲜膜将培养皿封口，封口膜上针扎20～30个小孔，所有培养皿放入人工气候箱内饲养，饲养1 d后观察结果，毛笔轻触桃蚜，不动者视为死亡。每个处理设置4次重复。用DPS V12.01求出毒力回归方程、标准误、LC50及其置信区间。

1.5 蛋白质含量的测定

参照考马斯亮蓝G-250法［13］，考马斯亮蓝染色液的配制：取考马斯亮蓝G-250 100 mg加入到50 mL 95%C2H5OH中，再加100 mL含量为85%的H2PO4后用蒸馏水定容至1 L。BSA（牛血清蛋白）标准蛋白液配制：准备6支试管洗净并干燥，依次用移液器加入BSA液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL后用蒸馏水定容至1 mL；每支试管中加入3 mL考马斯亮蓝染色液；将加液后的试管放入恒温水浴锅（25～30℃），20 min，使用紫外分光光度计测定A595。酶蛋白测定时，以酶液代替BSA标准液。以光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，制作标准曲线。

1.6 桃蚜谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性测定

选取无翅成蚜抗性和敏感品系各100头放入匀浆器中，向匀浆器中加入PBS（66 mmol/L，p H＝7.0）缓冲液4 mL冰上匀浆，匀浆液于高速低温离心机（4℃，12 000 r/min，15 min）离心，取上清稀释10倍4℃保存，作为酶源备用。谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）比活力测定参照Habig等的方法［14］稍有改进。反应混合液中含有酶液0.2 mL，PBS缓冲液（66 mmol/L，p H＝7.0）2.4 mL，GSH水溶液（50 mmol/L）0.3 mL，2，4-二硝基氯苯（0.03 mol/L）0.1 mL，27℃水浴5 min，测定A340，每个样品重复3次取平均值，以每分钟催化生成1μmol产物为1个活性单位，按照以下公式计算酶活力：

GSTs活力单位（μmol/min）＝（ΔA340·v）/（ε·L）

注：ΔA340为每分钟光吸收的变化值，v是酶促反应的体积，ε为产物消光系数［0.009 6 mol/（L·cm）］，L是比色杯的光程（1 cm）。按0.009 6 mol（L·cm）的消光系数计算谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）的比活力，单位为mmol/（mg·min）。

1.7 桃蚜磷酸酯酶活性测定

1.7.1 酸性磷酸酯酶（ACP）活性测定

参照Bessey的方法［15］并稍有改进，以对硝基苯酚为标准物质制作标准曲线。选取无翅成蚜抗性和敏感品系各100头放入匀浆器中，加入醋酸缓冲液（p H＝4.6，0.2 mol/L）1 mL冰上匀浆，匀浆液于高速低温离心机（4℃，12 000 r/min，15 min）离心，取上清液4℃保存作为酶源备用。以对硝基苯基磷酸二钠作为反应底物（终浓度为0.75 mmol/L），酶液用量分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，反应总体积用0.2 mol/L醋酸缓冲液配至3.0 mL，混合后37℃下水浴0.5 h，然后加入0.2 mol/L NaOH 2.0 m L终止反应，室温静置10 min测定A400，每个样品重复3次取平均值，根据制作的标准曲线和酶源蛋白含量的测定结果计算酸性磷酸酯酶（ACP）酶活性，以比活力［μmol/（mg·30 min）］表示。

1.7.2 碱性磷酸酯酶（ALP）活性

测定方法与1.7.1酸性磷酸酯酶（ACP）活性测定方法基本相同，碱性磷酸酯酶活性测定使用巴比妥缓冲液（0.4 mol/L，p H＝9.6）代替醋酸缓冲液（0.2 mol/L，p H＝4.6）。

1.8 羧酸酯酶（Car E）活性测定

选取无翅成蚜抗性和敏感品系各100头放入匀浆器中，向匀浆器中加入PBS（0.04 mmol/L，p H＝7.0）缓冲液4 m L冰上匀浆，匀浆液于高速低温离心机（4℃，12 000 r/min，15 min）离心，取上清液稀释25倍4℃保存，作为酶源备用。桃蚜羧酸酯酶（CarE）比活力测定参照van Asperen的方法［16］并稍有改进。反应混合液中含有羧酸酯酶酶液1 mL，α-醋酸萘酯（3×10－4mol/L）5 mL，30℃下水浴0.5 h，然后向反应体系中加入显色剂1 mL，室温静置0.5 h后测定A600，每个样品重复3次取平均值。根据制作的标准曲线和酶源蛋白含量的测定结果计算羧酸酯酶（CarE）酶活性，以比活力［μmol/（mg·min）］表示。

1.9 多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基活性测定

参照Hung等的方法［17］并稍有改进。选取无翅成蚜抗性和敏感品系各100头放入匀浆器中，向匀浆器中加入PBS（0.2 mmol/L，p H＝7.8）缓冲液1.5 mL冰上匀浆，匀浆液于高速低温离心机（4℃，10 000 r/min，15 min）离心，取上清液4℃保存，作为酶源备用。以对硝基苯甲醚为底物，在多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基的作用下，生成对硝基苯酚钠，以对硝基酚制作标准曲线。反应体系含酶液1 mL、1.0 mmol/L NADPH（缓冲液配制）0.5 mL、0.1 mmol/L对硝基苯甲醚（缓冲液配制）0.1 mL和缓冲液2.5 mL，在30℃水浴0.5 h然后加1.0 mmol/L的HCl 1 mL终止反应。向试管中加入氯仿5 mL进行萃取，待分层后从氯仿层中移取3 m L到另一试管内，加入0.5 mol/L的NaOH 3 m L萃取。取NaOH溶液层2 mL于比色皿中，测定A400值，根据对硝基苯酚标准曲线和酶源蛋白质含量，将A值换算成比活力μmol（mg·30 min），每个样品重复3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 生物测定结果

采用叶柄内吸法分别测定桃蚜敏感品系（THIS）和抗性品系（THI-R）对噻虫嗪的敏感性，测定结果见表1。

表1 桃蚜敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）对噻虫嗪的敏感性Table 1 Susceptibility of resistant and susceptible strains ofMyzus persicaeto thiamethoxam

由表1中数据可见，从湖南省郴州市安仁县熊蜂山自然保护区野生桃树上采集的桃蚜品系对噻虫嗪敏感，毒力回归方程中斜率大于2，表明该品系的同质性较高，该品系可以作为相对敏感品系。该敏感品系分出一部分用25%噻虫嗪可湿性粉剂进行抗性选育，经过15代继代选育，经生物测定数据可以看出已经产生了75.6倍的抗性，达到了高水平抗性。

2.2 桃蚜噻虫嗪抗性和敏感品系谷胱甘肽S-转移酶活性测定结果

对桃蚜噻虫嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）体内的谷胱甘肽S-转移酶活性进行测定并比较分析，结果见表2。敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）的谷胱甘肽S-转移酶比活力分别为3.127 5和3.215 9 mmol/（mg·min），差异不显著，表明桃蚜对噻虫嗪产生抗性与谷胱甘肽S-转移酶活性不相关。

2.3 桃蚜噻虫嗪抗性和敏感品系磷酸酯酶活性测定结果

桃蚜噻虫嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）体内磷酸酯酶的比活力测定结果见表3。敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）酸性磷酸酯酶的比活力分别是105.273 6和164.932 7μmol/（mg ·30 min）。抗性品系（THI-R）酸性磷酸酯酶的比活力是敏感品系（THI-S）的1.57倍，差异达到显著水平。敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）碱性磷酸酯酶的比活力分别是1.686 3和3.548 1μmol/（mg ·30 min）。抗性品系（THI-R）碱性磷酸酯酶的比活力是敏感品系（THI-S）的2.10倍，差异达到显著水平。说明桃蚜对噻虫嗪产生抗性可能与酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶均有关。

表2 桃蚜噻虫嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）谷胱甘肽S-转移酶活性比较1）Table 2 Comparison of glutathioneS-transferase activity between thiamethoxam-susceptible（THI-S）and thiamethoxam-resistant（THI-R）strains ofMyzus persicae

表3 桃蚜噻虫嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）磷酸酯酶比活力Table 3 Comparison of phosphoesterase activity between THI-Sand THI-R strains ofMyzus persicae

2.4 桃蚜噻虫嗪抗性和敏感品系羧酸酯酶测定结果

桃蚜噻虫嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）体内羧酸酯酶的比活力测定结果见表4，敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）羧酸酯酶的比活力分别是0.463 5和2.837 6μmol/（mg· min）。抗性品系（THI-R）羧酸酯酶的比活力是敏感品系（THI-S）的6.12倍，差异达到显著水平。

表4 桃蚜敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）羧酸酯酶比活力Table 4 Comparison of carboxylesterase activity between THI-Sand THI-R strains ofMyzus persicae

2.5 桃蚜噻虫嗪抗性和敏感品系多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基活性测定结果

通过测定和比较桃蚜噻虫嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）体内的多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基比活力（表5），结果表明两个品系的比活力差异显著，THI-R体内多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基比活力是THI-S的2.03倍，说明桃蚜对噻虫嗪的抗性可能与多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基活性有关。

表5 桃蚜敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）多功能氧化酶O-脱甲基比活力Table 5 Comparison of MFOO-demethylation activity between THI-Sand THI-R ofMyzus persicae

3 讨论

害虫抗药性产生主要涉及解毒酶代谢能力增强导致的代谢抗性和杀虫剂作用靶标敏感性降低导致的靶标抗性两方面［18］。杨焕青等发现吡虫啉抗性达到24.38倍的棉蚜体内谷胱甘肽S-转移酶的比活力是敏感品系的1.57倍［19］；史晓斌等发现对吡虫啉抗性达到42.19倍的棉蚜体内谷胱甘肽S-转移酶的比活力是敏感品系的1.58倍［20］，谷胱甘肽S-转移酶活力增加较缓慢；噻虫嗪作为第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，笔者研究发现桃蚜敏感品系和抗性品系的谷胱甘肽S-转移酶比活力分别为3.127 5和3.215 9，差异不显著，桃蚜对噻虫嗪产生抗性与谷胱甘肽S-转移酶不相关。

害虫体内水解酶数量与其他变化都是导致害虫抗药性的重要因子，帅霞等发现桃蚜对高效氯氰菊酯抗性品系的形成与碱性磷酸酯酶活性增强相关［9］。本研究发现桃蚜抗性品系中的酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶活性显著高于敏感品系，表明酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶是桃蚜对噻虫嗪产生抗药性的重要因素。

细胞色素P450主要依靠微粒体多功能氧化酶起作用，且该酶存在非常广泛底物的同工酶系，对进入害虫体内的有毒物质通过氧化代谢进行解毒。研究发现羧酸酯酶和细胞色素P450解毒代谢增强是害虫对烟碱类杀虫剂产生抗性的重要机制。邱高辉等发现用吡虫啉室内筛选麦长管蚜种群至25.22倍时，低水平抗性的代谢机理是多功能氧化酶和羧酸酯酶活力增强［21］；羧酸酯酶在昆虫代谢药物的过程中起着重要的作用［22］，随着棉蚜对吡虫啉抗性的增加，棉蚜体内的解毒酶活力逐渐增加，其中羧酸酯酶增长较快；利用PBO进行抑制试验发现：PBO对吡虫啉有显著增效作用，推测多功能氧化酶活力升高是棉蚜对吡虫啉产生抗性的机理之一［20］。桃蚜对有机磷类、氨基甲酸酯类、菊酯类药剂和吡虫啉抗药性的产生主要是其多功能氧化酶活性提高所引起［23-25］。本研究发现抗性品系羧酸酯酶、多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基的比活力分别是敏感品系的6.12倍和2.03倍，说明羧酸酯酶、多功能氧化酶（MFO）O-脱甲基活性升高与桃蚜对噻虫嗪的抗性密切相关。

单因子抗性发展速度快于多因素引起的抗性发展速度［26］，本研究通过室内选育建立桃蚜抗噻虫嗪种群属于单因子抗性，可以明确桃蚜对噻虫嗪抗性发展趋势，进而合理施药提高防治效果，延缓抗药性的发展；根据试验结果发现桃蚜对噻虫嗪的抗药性与4种解毒代谢酶相关，使用杀虫剂时可以适当加入增效剂，如增效磷、增效醚等起到增效效果。本文仅在生化水平初步研究了桃蚜对噻虫嗪代谢的抗性机制，有待进一步在分子水平进行更深入系统的研究。

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Metabolic mechanism of resistance to thiamethoxam inMyzus persicae

Zhang Pingyan， Zhou Xiaomao
（Institute of Pesticide Research，Hunan Agricultural University，Changsha410128，China）

Resistance screening ofMyzus persicae（Sulzer）to thiamethoxam was conducted in the laboratory.After 15 generations of selection，the resistance index ofM.persicaeto thiamethoxam was 75.6 folds.The activities of GSTs，ACP，ALP，CarE and MFOO-demethylation were tested in both sensitive（THI-S）and resistant（THIR）biotypes ofM.persicae.The results showed that the activity of GSTs in THI-Sand THI-R had no significant difference，with specific activity indexes of 3.127 5 and 3.215 9，respectively.However，the activities of ACP，ALP，CarE and MFOO-demethylation in THI-R were higher than those in THI-S，with indexes of 1.57，2.10，6.12 and 2.03，respectively.These results indicated that the resistance ofM.persicaeto thiamethoxam was related to the activities of ACP，ALP，CarE and MFOO-demethylation.

Myzus persicae； thiamethoxam； resistance； detoxification enzyme system

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.007

2014 01 16

2014 05 21

国家自然科学基金项目（31071716）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-10 0163）；公益性行业（农业）科研专项（201203038）

*通信作者 E-mail：zhouxm1972@126.com