腹水CD64及外周血mCD14检测在肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎中的价值研究

邹金海，王艳生

(河北省沧州市中心医院,河北 沧州 061001)

腹水CD64及外周血mCD14检测在肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎中的价值研究

邹金海，王艳生

(河北省沧州市中心医院,河北 沧州 061001)

目的探讨肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎(SBP)患者腹水CD64及外周血mCD14的变化及其意义。方法选取肝硬化合并腹水患者87例，根据是否合并SBP将患者分为2组：合并SBP 44例为研究组，未合并SBP 43例为对照组，采用流式细胞术检测2组患者腹水中性粒细胞和淋巴细胞CD64平均荧光强度、CD64指数，外周血白细胞计数、mCD14阳性表达率、mCD14平均荧光强度和mCD14指数。研究组抗感染治疗1周后再按治疗有效与无效、生存与死亡分组评价腹水中性粒细胞和淋巴细胞CD64平均荧光强度、CD64指数，外周血mCD14平均荧光强度和mCD14指数。结果研究组腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度、CD64指数和外周血白细胞计数明显高于对照组(P均<0.05)，淋巴细胞CD64平均荧光强度、mCD14阳性表达率、mCD14平均荧光强度和mCD14指数均明显低于对照组(P均<0.05)。治疗有效组和生存组中性粒细胞CD64平均荧光强度和CD64指数均明显低于治疗无效组和死亡组(P均<0.05)，淋巴细胞CD64平均荧光强度、mCD14平均荧光强度和mCD14指数均明显高于治疗无效组和死亡组(P均<0.05)。腹水CD64与外周血mCD14联合检测对治疗效果和预后判断的ROC曲线下面积、临界值、灵敏度和特异度均明显高于CD64、mCD14单项检测(P均<0.05)。结论肝硬化合并SBP患者腹水中性粒细胞CD64显著增高，腹水淋巴细胞CD64与外周血mCD14显著降低，腹水CD64与外周血mCD14联合检测预示肝硬化合并SBP治疗效果和预后的价值显著。

腹水；CD64；mCD14；肝硬化；自发性细菌性腹膜炎

肝硬化患者机体免疫力低下，门静脉高压形成，胃肠道充血、水肿，导致细菌容易通过损伤肠道黏膜屏障进入循环系统，造成自发性细菌性腹膜炎(Spontaneous bacterial peritonitis,SBP)，但早期SBP症状和体征缺乏特异性，早期诊治存在困难[1]。中性粒细胞CD64分子在细菌感染性疾病中显著增高，但在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、病毒感染性疾病等疾病中变化不明显[2]。mCD14是细菌细胞壁碎片识别受体之一，对细菌微生物免疫反应具有重要的作用。相关研究显示，mCD14在重症感染性疾病中显著减少，且与疾病病情程度显著相关[3]。目前关于腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化并SBP中的变化及其临床意义报道少见，故笔者进行了相关研究，现将结果报道如下。

1 临床资料

1.1一般资料 选取2013年4月—2014年4月在我院治疗肝硬化合并腹水患者87例，均符合《肝脏疾病预防与治疗指南》中关于肝硬化、腹水的诊断标准，血清清蛋白梯度(Serum albumin gradient，SAG)和腹水清蛋白梯度(Ascites albumin gradient，AAG)均≥11g/L。排除有腹腔外感染症状者，继发性腹腔感染、其他系统感染和有抗感染药物应用史者。根据临床症状、实验室检查结果明确是否合并SBP，SBP诊断标准：有腹痛腹泻、呕吐、腹部压痛和肠梗阻等局部腹膜炎症状，发热畏寒，外周血白细胞计数显著增高，呼吸急促，肝功能恶化，胃肠道出血，急性肾功能损伤，休克，肝性脑病，腹水中性粒细胞计数≥250×108L-1，腹水细菌培养阳性， SAG/AAG≥11g/L，其中符合SAG/AAG≥11g/L，其他项符合至少2项者确诊。根据是否合并SBP将患者分为2组：合并SBP 44例为研究组，男34例，女10例；年龄34～68(51.34±7.05)岁；疾病类型：乙肝病毒性肝硬化12例，丙肝病毒性肝硬化7例，酒精性肝硬化5例，乙肝病毒合并酒精性肝硬化8例，丙肝病毒合并酒精性肝硬化4例，肝硬化合并肝细胞癌3例，胆汁性肝硬化3例，隐源性肝硬化2例；肝功能Child-Pugh评分(10.28±2.01)分。未合并SBP 43例为对照组，男35例，女9例，年龄34～69(50.75±7.14)岁；疾病类型：乙肝病毒性肝硬化12例，丙肝病毒性肝硬化6例，酒精性肝硬化6例，乙肝病毒合并酒精性肝硬化7例，丙肝病毒合并酒精性肝硬化5例，肝硬化合并肝细胞癌2例，胆汁性肝硬化3例，隐源性肝硬化2例；肝功能Child-Pugh评分(10.04±1.49)分。2组患者性别、年龄、疾病类型和肝功能Child-Pugh评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 检测所有入选者腹水CD64和外周血mCD14水平。对于确诊为SBP患者均给予抗感染药物治疗1周，1周后再按治疗有效与无效、生存与死亡分组检测上述指标。疗效评估标准[4]：局部腹膜炎症状和全身炎症性症状逐渐缓解，腹水中性粒细胞计数<250×108L-1，腹水细菌培养阴性者评估为有效；局部腹膜炎症状和全身炎症性症状无改善甚至恶化，腹水中性粒细胞计数≥250×108L-1，腹水细菌培养阳性者评估为无效。

1.3检测方法 ①试剂与仪器：CANTO-Ⅱ流式细胞仪、Eppendorf 5810R高速冰冻离心机、CD64抗体试剂盒、红细胞裂解液、异硫氰酸荧光素标记性MCD14单克隆抗体、溶血素、同型免疫球蛋白由美国BD公司提供，System XT-2000i血常规仪，HITACHI7600型全自动生化分析仪，Stago-Compact 血凝功能分析仪，Cobase411电化学发光仪。②标本采集方法：入院治疗前采集外周血，送检血液常规、凝血功能、肝功能和肾功能等，腹腔穿刺术采集腹水，送检10～15 mL至常规细菌培养，5 mL腹水测定清蛋白水平，100 mL腹水用于细胞计数，100 mL腹水行流式细胞仪测定，5 h内完成腹水CD64测定，确诊SBP患者治疗1周后采集上述检测标本送检。③腹水CD64检测方法：将100 mL腹水250 g离心8 min，弃上清液，调整细胞数目至(1～2)×109L-1，取1 mL细胞悬浮液，采用50 μm尼龙筛网过滤至流式细胞专用试管中250 g离心8 min，弃上清液，100 μL细胞悬浮液加入CD64抗体20 μL，混合摇匀后室温环境下避光染色1 h，红细胞裂解液溶血洗涤后采用流式细胞仪测定中性粒细胞和淋巴细胞CD64平均荧光强度，计算CD64指数(中性粒细胞CD64平均荧光强度与淋巴细胞CD64平均荧光强度比值)。④mCD14检测方法：采用流式细胞术检测外周血单核细胞膜表面mCD14，采集50 μL外周全血与10 μL mCD14抗体孵育，室温环境下避光15 min，滴加1 mL溶血素，室温环境下避光10 min，1 000 r/min离心操作5 min，弃上清液，滴加PBS缓冲液离心5 min，弃上清液，滴加PBS缓冲液待测，采用同型免疫球蛋白对照，流式细胞仪采集样本，观察mCD14阳性表达率及mCD14平均荧光强度,计数mCD14指数。mCD14指数=mCD14阳性表达率×mCD14平均荧光强度×外周血白细胞计数/10 000。

2 结 果

2.12组腹水中性粒细胞和淋巴细胞CD64平均荧光强度及CD64指数比较 研究组中性粒细胞CD64平均荧光强度和CD64指数均明显高于对照组(P均<0.05)，淋巴细胞CD64平均荧光强度明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

2.22组外周血mCD14阳性表达率、mCD14平均荧光强度、mCD14指数及白细胞计数比较 研究组mCD14阳性表达率、mCD14平均荧光强度和mCD14指数均明显低于对照组(P均<0.05)，外周血白细胞计数明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

2.3治疗有效组和治疗无效组腹水CD64、外周血mCD14比较 治疗有效组中性粒细胞CD64平均荧光强度和CD64指数均明显低于治疗无效组，淋巴细胞CD64平均荧光强度、mCD14平均荧光强度和mCD14指数均明显高于治疗无效组(P均<0.05)。见表3。

表1 2组腹水中性粒细胞和淋巴细胞CD64平均荧光强度及CD64指数比较

组别nmCD14阳性表达率/%mCD14平均荧光强度外周血白细胞计数/109L-1mCD14指数研究组442.71±0.0745.62±14.074.41±1.05115.24±24.15对照组434.61±1.02127.36±15.023.71±0.09350.26±50.14t3.255.044.015.12P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.4生存组和死亡组腹水CD64、外周血mCD14比较 生存组中性粒细胞CD64平均荧光强度和CD64指数均明显低于死亡组(P均<0.05)，淋巴细胞CD64平均荧光强度、mCD14平均荧光强度和mCD14指数均明显高于死亡组(P均<0.05)。见表4。

2.5腹水CD64与外周血mCD14联合检测对治疗效果和预后的预测价值 根据ROC曲线(见图1和图2)，腹水CD64与外周血mCD14联合检测对治疗效果和预后的预测的ROC曲线下面积(AUC)、临界值、灵敏度和特异度均明显高于CD64、mCD14单项检测(P均<0.05)。见表5。

3 讨 论

晚期肝硬化免疫力显著降低，容易形成SBP，其中肝硬化合并脾脏功能异常者容易导致白细胞计数减少，合并细菌感染性疾病时，外周血白细胞计数同样减少[5],白细胞计数对于肝硬化合并SBP诊断灵敏度和特异度均较低。此外，临床用于细菌感染性疾病的评估指标有外周血中性粒细胞比例、血清CRP、降钙素原和红细胞沉降率等，但这些指标在急性创伤、外科术后、肿瘤转移浸润等情况下均显著增加[6]。腹水细菌培养是细菌感染的诊断金标准，但所需时间较长。CD64是免疫球蛋白IgG的Fc受体之一，是免疫球蛋白超家族成员，主要分布于中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，呈低表达水平。机体在细菌感染等应激性作用下，中性粒细胞CD64因子迅速升高，因此，CD64可作为细菌感染性疾病的早期诊断和评估标准[7]。单核细胞在重症感染性疾病的发生和发展中具有重要的意义。相关研究显示，重症胰腺炎外周血mCD14阳性表达率、mCD14平均荧光强度和mCD14指数表达较阴性对照组显著降低，其中存活患者上述指标逐渐升高，而死亡患者无显著升高倾向，说明mCD14低水平表达提示预后欠佳[8]。有研究显示，重症感染患者住院24h内采集外周全血测定mCD14表达较正常人群高，由于短期内免疫亢进现象导致；炎症发生24h后炎症免疫亢进现象消失，mCD14平均荧光强度较健康人群显著降低[9]。

表3 治疗有效组和治疗无效组腹水CD64、外周血mCD14比较

表4 生存组和死亡组腹水CD64、外周血mCD14比较

表5 腹水CD64与外周血mCD14联合检测对治疗效果和预后的预测价值

注：①与CD64联合mCD14检测比较，P<0.05。

图1 CD64、mCD14指数对治疗效果的预测价值

图2 CD64、mCD14指数对预后的预测价值

本研究结果显示，合并SBP患者中性粒细胞CD64平均荧光强度、CD64指数和外周血白细胞计数明显增高，而淋巴细胞CD64平均荧光强度明显降低，与文献[10]报道结果具有一致性。同时，mCD14阳性表达率、mCD14平均荧光强度和mCD14指数明显降低，提示肝硬化合并SBP患者处于免疫抑制状态。本研究结果还显示治疗有效患者和生存患者腹水CD64指数显著降低，外周血mCD14指数显著增高，CD64、mCD14指数两者联合对治疗效果的预测价值明显优于单项检测，与文献[11]报道相符 。

综上所述，肝硬化合并SBP患者腹水中性粒细胞CD64显著增高，腹水淋巴细胞CD64与外周血mCD14显著降低，腹水CD64与外周血mCD14联合检测预示肝硬化合并SBP治疗效果和预后的价值显著。

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Study on the value of combined detection of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 for hepatocirrhosis patients with spontaneous bacterial peritonitis

ZOU Jinhai, WANG Yansheng

(The Center Hospital of Cangzhou, Cangzhou 061001, Hebei, China)

Objective It is to investigate the change and significance of ascites CD64 and peripheral mCD14 for hepatocirrhosis patients with spontaneous bacterial peritonitis (SBP). Methods 87 hepatocirrhosis patients with ascites were selected and divided into two groups according to whether combined SBP, 44 cases combined SBP in research group, and 43 cases none SBP in control group. Flow cytometry was used to detect the average fluorescent intensity and index of CD64 in ascites neutrophils and lymphocytes, and the peripheral blood white blood cell count, mCD14 positive expression rate, mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index of the two groups. The fluorescent intensity and index of CD64 in ascites neutrophils and lymphoctesand the peripheral blood mCD14 in research group were compared according to effective and invalid, survival and death respectively. Results The neutrophils CD64 average fluorescence intensity and CD64 index of and peripheral blood leukocyte count of the research group were significantly higher than those of the control group (allP<0.05), the lymphocyte CD64 average fluorescence intensity, mCD14 positive expression rate, monocytes mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index were significantly lower than those of the control group (allP<0.05). The neutrophils CD64 average fluorescence intensity and CD64 index of effective treatment/survival group were significantly lower than those of ineffective/death group (allP<0.05), and lymphocyte CD64 average fluorescence intensity, monocytes mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index were significantly higher than those of ineffective/death group (allP<0.05). The area under the ROC curve (AUC), the critical value, sensitivity and speciality rate of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 combined detection for therapeutic effect and prognosis prediction were significantly higher than those of CD64 or mCD14 single detection (allP<0.05). Conclusion Ascites neutrophils CD64 level is significantly higher, ascites lymphocytes CD64 and peripheral blood mononuclear cells mCD14 levels is decreased significantly, the combined detection of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 has significant value in the predicts therapeutic effect and prognosis for hepatocirrhosis with SBP.

ascites; CD64; mCD14; hepatocirrhosis; spontaneous bacterial peritonitis

邹金海，男，硕士研究生，副主任医师，主要从事专业核医学技术与免疫学技术在临床中的应用研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.30.006

R657.31

A

1008-8849(2015)30-3324-04

2015-03-30