HSP90抑制剂IPI-504影响胃癌细胞及其干细胞样细胞功能的研究

黄 磊，黄 侠，蔡一亭，陈大伟，费哲为

(1. 上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092；2. 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院，上海 202150)

HSP90抑制剂IPI-504影响胃癌细胞及其干细胞样细胞功能的研究

黄 磊1，黄 侠2，蔡一亭2，陈大伟2，费哲为1

(1. 上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092；2. 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院，上海 202150)

目的探讨特异性热休克蛋白90(HSP90)抑制剂盐酸瑞他霉素(IPI-504)对人胃癌细胞SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法应用流式细胞仪检测及分选SGC-7901、NCI-N87中干细胞样细胞；应用MTT比色法检测不同浓度IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞的生长抑制率；应用平板克隆形成实验检测不同浓度IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞的克隆形成能力；应用划痕实验及Transwell侵袭实验检测IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞迁移及侵袭力；应用流式细胞仪检测IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞凋亡率的影响。结果从SGC-7901、NCI-N87分选出8%和6%的CD44+干细胞样细胞，纯度>95%；IPI-504能显著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力，增加以上细胞的凋亡率，且呈剂量依赖性。结论HSP90抑制剂IPI-504能够显著抑制胃癌细胞SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞的功能，并促使其凋亡。

盐酸瑞他霉素；热休克蛋白90；胃癌；CD44+干细胞样细胞

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，尽管目前在胃癌临床治疗上采取了手术、放化疗以及基因治疗在内的各种新策略，但生存率仍不超过40%。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells，CSC)的提出为充分认识胃癌的发病机制提供了新的思路[1]。该理论认为,肿瘤是由极少数具有自我更新和分化增殖特征的肿瘤细胞形成，能进一步分化产生大量非致瘤性肿瘤细胞，通过对特定的免疫表型分离鉴定肿瘤干细胞是最常用的方法。热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)是一种广泛存在于细胞中的分子伴侣，能够调控包括肿瘤在内的各种细胞中的多种信号通路[2]。而HSP90抑制剂能够同时削弱多条原癌基因信号通路，抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡，已经成为非常有前景的胃癌治疗策略。本课题通过免疫标记物特异性分选出胃癌细胞SGC-7901、NCI-N87中干细胞样细胞，研究HSP90抑制剂盐酸瑞他霉素(Retaspimycin Hydrochloride，IPI-504)对胃癌细胞及其干细胞样细胞的增殖、转移以及凋亡的影响，旨在为今后的临床应用提供理论依据。

1 实验资料

1.1材料 胃癌低分化细胞株SGC-7901及胃癌高分化转移细胞株NCI-N87购买于中国科学研究院细胞库。IPI-504及5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)购自Med Chem express公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶(PI)购自Sigma公司。PE-CD24抗体、FITC-CD44抗体、PE-CD133抗体、细胞侵袭小室及Annexin V-FITC试剂盒购自BD公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 常规于37 ℃、5%CO2培养箱内，于RPMI-1640完全培养基中培养SGC-7901及NCI-N87。

1.2.2流式细胞分选 对数生长期细胞用胰酶消化，PBS重悬并计数，分别加入PE-CD24抗体、FITC-CD44抗体、PE-CD133抗体混合(终浓度5 μg/mL)，置于37 ℃避光环境孵育30 min，PBS洗涤后上机分选，分选出的细胞置于完全培养基中继续培养。

1.2.3MTT法检测细胞活性 对数生长期的细胞接种于96孔板中(1×104/100 μL)并待其贴壁，分别加入不同浓度梯度的IPI-504或5-Fu处理，48 h后加入MTT工作液，4 h后再加入DMSO并检测OD值。细胞存活率=(试验组OD平均值-背景组OD平均值)/(空白对照组OD平均值-背景组OD平均值)×100 %。

1.2.4平板克隆形成试验 对数生长期细胞消化、计数，稀释成150个/孔种于24孔板中，24 h后分别换成含有6 μg/mL或9 μg/mL IPI-504的完全培养基培养14 d，冰冻甲醇固定，0.1%的结晶紫染色，拍照计数20个细胞数以上的细胞集落个数。

1.2.5划痕实验检测细胞迁移能力 细胞以8×105/孔接种到24孔板，24 h后使用无菌加样器枪头将细胞培养层划出数道划痕，洗去漂浮细胞，用IPI-504以0 μg/mL、6 μg/mL、9 μg/mL 3个浓度培养，在即刻、24 h、48 h分别拍照，计数3个不同区域距离。细胞迁移率=(处理组细胞迁移距离/对照组细胞迁移距离)×100%。

1.2.6Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力 细胞消化计数，用无血清的培养基调整为5×105/孔种于Transwell侵袭小室，37 ℃下培养48 h后取出。冰冻甲醇固定，0.1%的结晶紫染色后擦除上室细胞，置于倒置显微镜下并取5个视野拍照计数。

1.2.7流式细胞仪检测细胞凋亡情况 按照Annexin V-FITC试剂盒说明书方法，将IPI-504处理后的细胞消化，加入400 μL Annexin V-FITC结合液完全悬浮，加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃下避光孵育10 min，后加入10 μL PI 4 ℃下避光孵育5 min，上机检测细胞凋亡情况。

2 结 果

2.1SGC-7901、NCI-N87细胞中CD44+细胞的分离 用CD24和CD133标记这两株细胞的阳性率几乎为0，而对CD44标记，SGC-7901阳性率为8%，NCI-N87阳性率为6%。因此采用CD44来标记胃癌细胞株，并用流式细胞仪分选出CD44+的细胞，其中分选出的细胞纯度> 95%。

2.2IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞活率的影响 以PBS为阴性对照，以5-Fu为阳性对照，结果显示IPI-504相对于SGC-7901、SGC-7901CD44+、NCI-N87、NCI-N87CD44+的IC50值分别为24.4μmol/L、33.7μmol/L、2.67μmol/L、41.18μmol/L。而5-Fu相对于SGC-7901、SGC-7901CD44+、NCI-N87、NCI-N87CD44+的IC50值分别为35.3μmol/L、72.7μmol/L、121μmol/L、154μmol/L。

2.3IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞克隆形成能力的影响 用0μg/mL(control)、6μg/mL与9μg/mL浓度IPI-504处理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞，结果显示与未用药的control组相比，IPI-504处理后各组克隆形成能力显著降低，且与剂量呈显著相关性，9μg/mL处理组只见少量克隆生长。见图1。

图1 平板克隆形成实验验证IPI-504对胃癌细胞克隆形成的影响

2.4IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞迁移能力的影响 用0μg/mL(control)、6μg/mL与9μg/mL浓度IPI-504处理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞24h和48h。结果显示，与control组相比，IPI-504 6μg/mL与9μg/mL浓度能显著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞的迁移能力(P均<0.05)；随IPI-504浓度增加，细胞迁移能力减弱(P均<0.05)。见图2～5。

2.5IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞侵袭能力的影响 用6μg/mL浓度IPI-504处理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞，结果显示与control组相比，IPI-504能显著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞的侵袭能力(P均<0.05)。见图6及图7。

图2 不同浓度IPI-504对SGC-7901细胞迁移能力的影响

图3 不同浓度IPI-504对SGC-7901 CD44+细胞迁移能力的影响

图4 不同浓度IPI-504对NCI-N87细胞迁移能力的影响

图5 不同浓度IPI-504对NCI-N87 CD44+细胞迁移能力的影响

2.6IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞凋亡的影响 用0μg/mL(control组)、6μg/mL、9μg/mL、18μg/mL4个浓度IPI-504分别处理SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞48h后，结果显示与control组相比，IPI-504能显著促进SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞的凋亡；随着IPI-504浓度的增加，细胞凋亡率增加。见图8。

图6 IPI-504对SGC-7901及其CD44+细胞侵袭能力的影响

图7 IPI-504对NCI-N87及其CD44+细胞迁移能力的影响

图8 不同浓度IPI-504对SGC-7901、NCI-N87及其CD44+细胞凋亡影响

3 讨 论

目前胃癌的治疗主要是根治性手术切除及辅助放化疗，但效果不甚理想，仍有约50%的患者会因肿瘤的复发、转移及耐药而导致死亡。近年发展起来的肿瘤干细胞学说认为CSC是肿瘤中一小部分具有自我更新及多项分化潜能的细胞，与肿瘤的多种重要的生物学行为如耐药、免疫抑制及上皮-间质转化等相关，这些性质促使CSC能够抵抗放化疗的攻击，导致肿瘤复发及远处转移[3]。多种类型的CSC已经验证存在与成体干细胞相同或相似的表面标志物，如CD44、CD24、CD133[5]等。因此，本研究应用上述标志物分别对2种有代表性的胃癌细胞即低分化细胞株SGC-7901及胃癌高分化转移细胞株NCI-N87进行筛选，结果发现仅有CD44在2种细胞中均有阳性表达，这与Takaishi等[4]研究结果相符，即CD44可用于识别及筛选出胃癌干细胞。此外，Yoon等[5]研究发现胃癌干细胞高表达CD44，且与肿瘤的浸润转移能力以及耐5-Fu和卡铂相关。因此本实验通过进一步分选CD44+细胞，用以证实胃癌干细胞样细胞。

HSP是一类结构上高度保守的蛋白质，按照其分子量的大小主要分为HSP90、HSP70、HSP60以及小分子HSP等，其广泛存在于各类生物细胞中，具有稳定蛋白、提高细胞生存等功能[6]。近年来的研究发现HSP90在胃癌组织中较正常组织表达高2～10倍[7]。目前已经有超过100种蛋白如突变型P53、BCR-ABL、AKT、HER2被确定为HSP90的客户蛋白，能够促进癌细胞增殖、转移、耐药以及抑凋亡的作用[7-9]。因此使用HSP90抑制剂阻断多种肿瘤信号通路，从而消除肿瘤成为一种重要的抗癌治疗策略。格尔德霉素属于苯醌安莎霉素类抗生素，是一种天然存在的HSP90功能抑制剂，其安莎环可通过与HSP90-N端ATP/ADP结构域特异性地抑制HSP90与多种肿瘤相关蛋白的相互作用[10]。然而其水溶性差，体内分布特异性差及肝毒性强，其衍生物如17-AAG、17-DMAG等水溶性提高，亲和力提高100倍。

17-AAG的盐酸衍生物IPI-504由InfinityPharmaceuticals公司研发[11]。Floris等[12]的研究发现，IPI-504能够通过HSP90阻碍KIT的功能，抑制胃肠肿瘤的增长。本实验发现，IPI-504能够显著抑制SGC-7901、NCI-N87及其CD44+干细胞样细胞的增殖、迁移以及侵袭能力，显著促进胃癌细胞的凋亡，并且存在剂量依赖性。

综上所述，HSP90抑制剂IPI-504能够显著抑制胃癌细胞及其干细胞样细胞增殖、迁移、侵袭能力，促进胃癌细胞及其干细胞样细胞的凋亡。但其通过抑制HSP90作用于细胞信号通路的机制有待进一步探索。

[1]QiaoXT,GumucioDL.Currentmolecularmarkersforgastricprogenitorcellsandgastriccancerstemcells[J].JGastroenterol,2011,46(7):855-865

[2]RappaF,FarinaF,ZummoG,etal.HSP-molecularchaperonesincancerbiogenesisandtumortherapy:anoverview[J].AnticancerRes,2012,32(12):5139-5150

[3]ShatsI,GatzaML,ChangJT,etal.Usingastemcell-basedsignaturetoguidetherapeuticselectionincancer[J].CancerRes,2011,71(5):1772-1780

[4]TakaishiS,OkumuraT,WangTC.Gastriccancerstemcells[J].JClinOncol,2008,26(17):2876-2882

[5]YoonC,ParkDJ,SchmidtB,etal.Hedgehogsignalingmaintainsgastriccancerstemcellsandpromoteschemotherapyresistance:resultsfromlaboratoryandclinicalstudies[J].CancerRes,2014,74(19Suppl):3873

[6]HongDS,BanerjiU,TavanaB,etal.Targetingthemolecularchaperoneheatshockprotein90 (HSP90):lessonslearnedandfuturedirections[J].CancerTreatRev,2013,39(4):375-387

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[12]FlorisG,Debiec-RychterM,WozniakA,etal.Theheatshockprotein90inhibitorIPI-504inducesKITdegradation,tumorshrinkage,andcellproliferationarrestinxenograftmodelsofgastrointestinalstromaltumors[J].MolCancerTher,2011,10(10):1897-1908

Study on the effect of HSP90 inhibitor IPI-504 on gastric cancer cells and its stem cell like cells

HUANG Lei1, HUANG Xia2, CAI Yiting2, CHEN Dawei2, FEI Zhewei1

Objective It is to investigate the influence of the heat shock protein 90 (HSP90) inhibitor Retaspimycin Hydrochloride (IPI-504) on the ability of proliferation, migration, invasion and apoptosis in gastric cancer cells of SGC-7901, NCI-N87 and their CD44+stem cell like gastric cancer cells. Methods Flow cytometry was used to detect and sort the stem cell like cells in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer cells. MTT colorimetric assay was utilized to compare the effort of IPI-504 on the inhibition ratio in SGC-7901, NCI-N87 and their CD44+stem cell like gastric cancer cells. Colony formation assay was executed to test the effort of IPI-504 on colony formation ability in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells. Scratch test and Transwell invasion assay was applied to detect the effort of IPI-504 on migration and invasion ability in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells. Flow cytometry was also used to detect the effect of IPI-504 on the apoptosis in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells. Results 8% and 6% CD44+stem cell like cells was sorted from SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer cells with purity >95%. IPI-504 could dramatically inhibit the abilities of proliferation, migration, invasion and colony formation in SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells and significantly raise the apoptosis in these cells as dose dependent. Conclusion HSP90 inhibitor IPI-504 can suppress the cells function of SGC-7901, NCI-N87 gastric cancer and their CD44+stem cell like cells, and promote their apoptosis.

Retaspimycin Hydrochloride; heat shock protein 90; gastric cancer; CD44+stem cell like cells

黄磊，主治医师，研究方向为胃肠疾病的外科诊疗。

费哲为，E-mail：zheweifei@xinhuamed.com.cn

上海市卫生局课题(ZK2012B15)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.30.004

R735.2

A

1008-8849(2015)30-3317-04

2014-10-10

(1. Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China; 2. Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Chongming Branch, Shanghai 202150, China)