曲美他嗪对糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤保护作用研究

梁俊文，郭志强，林嘉敏，邓启垣，何文飞

(广东省佛山市南海区第二人民医院，广东 佛山 528251)

曲美他嗪对糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤保护作用研究

梁俊文，郭志强，林嘉敏，邓启垣，何文飞

(广东省佛山市南海区第二人民医院，广东 佛山 528251)

目的 探讨曲美他嗪对糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤的保护作用机制。方法将健康雄性Wistar大鼠60只随机分为对照组、模型组、实验A组、实验B组、实验C组,每组12只。对照组采用标准颗粒饲料喂养;模型组和实验各组采用高糖高脂饲料喂养，于第6周一次性腹腔注射链脲佐菌素(FTZ )30 mg/kg，注射后72 h，筛选血糖水平连续2次高于11.1 mmol/L的大鼠，继续原饲料喂养6周，同时实验A组、B组、C组分别腹腔注射10,30,90 mg/(kg·d)曲美他嗪干预6周。末次给药12 h后，观察比较5组大鼠的心功能、心肌酶谱、TGF-β1蛋白及TGF-β1mRNA表达情况。结果 模型组的肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、TGF-β1、丙二醛(MDA)、TGF-β1mRNA水平均显著高于对照组和实验各组(P均<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)、miR-21水平显著低于实验各组和对照组(P均<0.05)；实验各组CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平随着曲美他嗪用量的增加而逐步下降，SOD、miR-21水平则显著升高，实验C组的CK、LDH、TGF-β1、 MDA、SOD、TGF-β1mRNA、miR-21水平与对照组最接近，但CK、LDH、MDA、TGF-β1mRNA水平仍高于对照组(P均<0.05)。模型组FS、LVEF、IRVT、E/A均显著低于实验各组和对照组(P均<0.05)；实验各组的E/A、FS、LVEF、IRVT均低于对照组(P均<0.05),且随着曲美他用量的增加上述各指标逐步接近对照组。结论 曲美他嗪可以通过调控MAPK-microRNA通路改善心肌酶、心功能等指标，保护心肌，减轻心室重构,随着剂量增加效果更加显著。

曲美他嗪；糖尿病；心肌病；心肌损伤

糖尿病性心肌病是指发生于糖尿病患者的非高血压性心脏病、心脏瓣膜病、冠状动脉粥样硬化性心脏病及其他心脏疾病。糖尿病性心肌病患者多因代谢紊乱或微血管病变出现的心肌广泛性灶性坏死而发病，发病患者将出现亚临床心功能障碍，并逐步发展为心律失常、心力衰竭、心源性休克等，严重时可诱使患者死亡[1]。糖尿病性心肌病主要以药物治疗为主，包括控制血糖，降血压、血脂，抗心绞痛、心力衰竭治疗等[2]。抗心力衰竭治疗是糖尿病性心肌病的核心内容，常用药物有曲美他嗪、非洛地平缓释片等。曲美他嗪在改善糖尿病性心肌病患者血糖、血压水平方面具有显著疗效，但对心肌损伤的疗效及其作用机制临床尚无定论。故本研究探讨了曲美他嗪对糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤的保护作用及其机制，现报道如下。

1 实验资料

1.1实验动物 健康成年雌性Wistar大鼠60只，4～5周龄，体质量138～152(144.4±4.4)g，中山大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2004-0011,饲养于25 ℃的标准环境，自由饮食进水，光照周期12 h。

1.2 实验仪器与药品 BIORAD imar全自动酶标仪，贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪，海精科科学仪器有限公司提供的722分光光度计，Odyssey 扫描仪；苏州拜吉氏生物科技有限公司生产的STZ试剂，上海禾丰制药有限公司生产的ISO试剂，南京建成生物工程研究所提供的乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、磷酸肌酸激酶(CPK)试剂盒，Gaithersburg MD USA提供的鼠抗羊GAP-DH单抗、鼠抗人Caveolin-3单抗DH；链脲佐菌素(FTZ ，中美上海施贵宝制药有限公司生产，国药准字H31022516 )，高糖高脂饲料(广西平南制药厂生产，国药准字B20020169 )，戊巴比妥钠(吉林省中研药业有限公司生产，国药准字H22025189 )，曲美他嗪(施维雅(天津)制药有限公司生产，国药准字H20055465)。

1.3 动物分组及造模方法 采用随机数值表法将健康成年雌性Wistar大鼠60只分为对照组、模型组、实验A组、实验B组、实验C组,每组12只。对照组采用标准颗粒饲料喂养6周；模型组和实验各组采用高糖高脂饲料(大鼠基础饲料68.8%、蔗糖10%、蛋黄粉10%、猪油10%、胆固醇1%、胆盐0.2%)喂养6周，在第6周一次性腹腔注射FTZ 30 mg/kg，注射后72 h测定空腹血糖，如血糖水平连续2次高于11.1 mmol/L视为构建糖尿病模型成功。随后，继续用高糖高脂饲料喂养造模大鼠6周，同时实验A组、实验B组、实验C组分别给予10，30，90 mg/(kg·d)的曲美他嗪干预6周；对照组继续采用标准颗粒饲料喂养6周。

1.4 检测指标 ①末次给药12 h后，采用飞利浦公司生产的iE33型彩色 Deppler超声仪检测5组大鼠心功能。②颈静脉采血检测肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，CK、LDH选用全自动生化分析仪按仪器说明书进行检测，MDA、SOD采用ELISA法检测。③选用脊椎脱臼法处死大鼠，取出心脏，冲洗，减去包膜、血管及心房组织，称质量，于左心室长轴中点切取2 mm后的左心室截面组织，置于甲醛内，24 h后包埋，其余组织编号后冰冻保存。选用免疫组化分析方法检测TGF-β1在心肌内的表达水平，操作严格按说明书进行。取100 mg心肌组织，匀浆后提取RNA，选用分光光度仪检测RNA浓度。PCR扩增后，选用BIORAD imar全自动酶标仪进行分析并计算TGF-β1mRNA、miR-21表达水平。

2 结 果

2.1各组血清及心肌检测指标比较 模型组CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平均显著高于对照组和实验各组(P均<0.05)，SOD、miR-21水平显著低于实验各组和对照组(P均<0.05)；实验各组CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平随着曲美他嗪用量的增加而逐步下降，SOD、miR-21水平则显著升高，实验C组的CK、LDH、TGF-β1、 MDA、SOD、TGF-β1mRNA、miR-21水平与对照组最接近，但CK、LDH、MDA、TGF-β1mRNA水平仍高于对照组(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组心功能指标比较 模型组的FS、LVEF、IRVT、E/A值均显著低于实验各组和对照组(P均<0.05)；实验各组的FS、LVEF、IRVT、E/A值均低于对照组(P均<0.05),且随着曲美他嗪用量的增加上述各指标逐步接近对照组。见表2。

3 讨 论

糖尿病性心肌病病因可能与心肌细胞代谢紊乱、心肌细胞钙运转缺陷、冠状动脉微血管病变、心脏自主神经损伤、心肌间质纤维化等有关[3]。该类疾病患者主要存在心律失常、心肌梗死面积增加、细胞能量代谢障碍、线粒体损伤以及细胞凋亡增加等情况。MDA是氧化应激反应的重要参照物，而氧化应激反应主要通过细胞膜结构变化而生成脂质过氧化，并破坏酶及蛋白质结构，损伤患者染色体及核酸，最终导致细胞凋亡、组织损伤[4]。SOD则是氧自由基清除剂的一种，心肌出现缺血性损伤时，细胞内过量的氧自由基将消耗SOD，故糖尿病性心肌病组大鼠SOD表达水平降低[5]。CK是动物心脏、脑等组织内存在的一种承担着细胞内能力运作、肌肉收缩以及ATP再生的重要物质，CK高表达提示患者可能伴不同程度的肌肉萎缩、心肌梗死症状[6]。 LDH是糖酵解酶的一种，多存在于动物组织细胞的胞质内，是临床常用心肌疾病诊断参照物之一，高表达的LDH提示患者可能伴急性心肌梗死、地中海贫血、恶性贫血等症状。TGF-β1mRNA具有抑制细胞凋亡的效用，其作用机制可能与TGF-β1mRNA调控靶向基因PTEN及MAPK磷酸化水平有关[7]。miR-21是一种具有调控功能的小分子RNA，对生物细胞的生长、发育、衰老、死亡具有重要作用，是临床常用的肿瘤及其他相关疾病诊断参照物。

表1 各组血清及心肌检测指标比较

注：①与对照组比较,P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

表2 各组心功能测定指标比较

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

曲美他嗪是临床常用治疗心绞痛药物，其可抑制线粒体长链3-酮脂酰辅酶 A 硫解酶生成，进而抑制脂肪酸β-氧化供能途径，优势心肌能力代谢方式过度为葡萄糖氧化，增强心肌能量供应效率；可改善人体左心室结构功能，激活冬眠细胞及顿抑细胞，最终增强心脏收缩能力；还可抑制自由基合成，维持线粒体功能，降低心肌对氧的需求，提高氧的利用率，产生大量的高能磷酸键，缓解患者心肌缺血症状，改善心肌氧供平衡[8]；还可减少细胞内Ca2+、Na+含量，提高乳酸利用率，抑制酮体生成，降低细胞缺氧性酸中毒发病率[9]。

本研究结果显示，模型组CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平均显著高于对照组和实验各组，SOD、miR-21水平显著低于实验各组和对照组；实验组CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平随着曲美他嗪剂量的增加而逐步下降，SOD、miR-21水平则显著升高，实验C组的CK、LDH、TGF-β1、 MDA、SOD、TGF-β1mRNA、miR-21水平与对照组最接近，但CK、LDH、MDA、TGF-β1mRNA仍高于对照组。模型组的FS、LVEF、IRVT、E/A均显著低于实验各组和对照组；实验各组的E/A、FS、LVEF、IRVT低于对照组,且随着曲美他用量的增加上述各指标逐步接近对照组。提示曲美他嗪可改善糖尿病性心肌病大鼠心功能，其机制可能为曲美他嗪通过激活内源性或外源性TGF-β1mRNA信号受体，进而激活下游凋亡通路，包括依赖或不依赖caspase的凋亡途径，最终对抑制或促进凋亡的基因进行修饰，最终实现改善心肌细胞损伤的效果[10]。

综上所述，曲美他嗪可以通过调控MAPK-microRNA通路改善心肌酶、心功能等指标，平衡心肌氧供，改善糖尿病性心肌病大鼠症状。

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Study on the protective effect of trimetazidine on myocardial injury in the rats with diabetic cardiomyopathy

LIANG Junwen,GUO Zhiqiang,LIN Jiamin,DENG Qihuan,HE Wenfei

(The Second People's Hospital of Nanhai District,Foshan 528251,Guangdong,China)

Objective It is to investigate the mechanism of the protective effect of trimetazidine on myocardial injury in the rats with diabetic cardiomyopathy.Methods 60 healthy male Wistar rats were selected and randomly divided into control group,model group,the experimental group A,experimental group B,experimental group C,each group had 12 rats.The control group was fed with standard pelleted diet,model group and every experimental group with high sugar and fat feed,all the rats were given streptozotocin(FTZ 30 mg/kg) by intraperitoneal injection on the sixth week,72 h after injection,the rats whose blood glucose levels were higher than that of 11.1 mmol/L for two times were selected and continue to feed with the original diet for 6 weeks,at the same time the experimental group A,B,C were treated with trimetazidine of 10,30 and 90 mg/(kg·d) by intraperitoneal injection for 6 weeks.In 12 h after the last therapy,heart function,myocardial enzyme spectrum,TGF-β1protein and the expression of mRNA of TGF-β1of the rats in the five groups were observed and compared.Results The levels of CK,LDH,TGF-β1,MDA,TGF-β1mRNA in model group were significantly higher while the levels of SOD and miR-21 were lower than that of control group and experiment groups (P<0.05).The levels of CK,LDH,TGF-β1,MDA,TGF-β1mRNA gradually decreased while the levels of SOD and miR-21 increased with the increasing of trimetazidine dose.The levels of CK,LDH,TGF-β1,MDA,SOD,TGF-β1mRNA,miR-21 in group C were most closely to the control group,but the levels of LDH,MDA,TGF-β1mRNA were still higher than that of control group (P<0.05).FS,LVEF,IRVT,E/A in model group were significantly lower than that of control group and experiment groups (P<005),FS,LVEF,IRVT,E/A in experiment groups were significantly lower than that of control group(P<005),and with the increase of trimetazidine dose these indices gradually close to the control group.Conclusion Trimetazidine can improve cardiac function and myocardiac enzymes,protect myocardium,reduce ventricular remodeling,through regulation of MAPK-microRNA pathway,the effects were more significant with the increase of dosage.

trimetazidine; diabetic cardiomyopathy; myocardial injury

梁俊文，女，主治医师，从事内科疾病诊治工作。

佛山市医学类科技攻关项目(201308187)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.13.004

R-332

A

1008-8849(2015)13-1378-03

2014-10-23