外周血Th17细胞在炎症性肠病活动度评估中的临床意义*



外周血Th17细胞在炎症性肠病活动度评估中的临床意义*

高楠1#戴娟1张光波2李月芹1李锐1陈卫昌1&

苏州大学附属第一医院消化内科1(215006)苏州大学免疫研究所2

*基金项目：2011年度苏州市科教兴卫青年科技项目(KJXW2011001)

#Email: carrie_gn@126.com

背景：Th17细胞在免疫炎症反应中发挥重要作用，其与炎症性肠病(IBD)的关系已成为相关领域的研究热点。目的：初步探讨Th17细胞在IBD发病机制中的作用以及外周血Th17细胞在IBD活动度评估中的临床意义。方法：收集来自5家医院的IBD患者81例[克罗恩病(CD)39例，溃疡性结肠炎(UC)42例]和健康志愿者40名，采集外周血标本，分离单个核细胞，经佛波酯和伊屋诺霉素联合刺激后，以流式细胞术检测外周血CD4+T细胞中的Th17细胞比率，同时测定临床炎症指标ESR和血清CRP。结果：CD组和UC组外周血Th17细胞比率分别为2.51%±1.59%和4.15%±2.75%，均显著高于对照组的1.44%±0.73%(P均<0.05)，其中UC组显著高于CD组(P<0.01)，活动期CD和UC分别显著高于缓解期CD和UC(CD: 3.39%±1.56%对1.48%±0.81%,P<0.01; UC: 5.77%±2.77%对2.18%±0.59%,P<0.01)。Spearman秩相关系数分析显示，活动期CD和UC外周血Th17细胞比率与ESR、CRP均呈正相关(CD与ESR：rs=0.851，CD与CRP：rs=0.793，UC与ESR：rs=0.817，UC与CRP：rs=0.873，P均<0.05)。结论：Th17细胞参与了IBD的发生、发展过程，在UC发病中的作用可能更为重要。检测外周血Th17细胞比率可能有助于IBD疾病活动度的评估。

关键词炎症性肠病；Th17细胞；红细胞沉降率；C反应蛋白

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcer-ative colitis, UC)，其病因尚未完全阐明，目前观点认为遗传易感性、感染、免疫、环境、微生物等多种因素共同参与了IBD的发病，免疫因素在其中占主导地位。IBD临床表现复杂多样且易反复发作，疾病活动度的评估一般采用结肠镜检查，但用于病情监测因检查过程较痛苦而难以为患者所接受。

Th17细胞是Th1、Th2细胞以及调节性T细胞(Treg细胞)之外的又一重要T细胞亚群，在免疫炎症反应中发挥重要作用。近年研究发现多种自身免疫性疾病中存在Th17细胞产生的白细胞介素-17(IL-17)表达增高[1-8]，Th17细胞与IBD的关系已成为相关领域的研究热点。本研究采用流式细胞术检测IBD患者外周血CD4+T细胞中的Th17细胞比率及其与临床炎症指标红细胞沉降率(ESR)和血清C-反应蛋白(CRP)的关系，初步探讨Th17细胞在IBD发病机制中的作用以及外周血Th17细胞在IBD活动度评估中的临床意义，为IBD的临床辅助诊断提供新思路。

材料与方法

一、研究对象

收集2011年5月—2012年7月在苏州大学附属第一医院、常熟市第二人民医院、苏州市立医院、昆山市第二人民医院、太仓市第一人民医院五家医院就诊的IBD患者81例，其中CD 39例，UC 42例，诊断符合2007年中华医学会消化病学分会IBD协作组《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[9]。分别根据简化CD活动指数(CDAI)和Southerland疾病活动指数对CD和UC患者进行病情分期[9]，CD组活动期21例，缓解期18例，UC组活动期23例，缓解期19例。选取同期苏州大学附属第一医院健康志愿者40名(排除IBD以及相关疾病家族史)作为对照组。CD、UC组与对照组间性别构成、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。研究方案经医院伦理委员会审核批准，入组受检者标本留取前均签署知情同意书。

二、方法

1. 分离、培养外周血单个核细胞(PBMCs)：采集受检者外周静脉血(EDTA-K2抗凝)，取2 mL，按1∶1的比例与PBS混匀，Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs；将细胞重悬于RPMI 1640培养基中，调整细胞浓度为2×106/mL。

2. 细胞刺激：按试剂说明书在PBMCs悬液中分别加入刺激剂佛波酯(PMA, 1 μg/mL)和伊屋诺霉素(IM, 1 μg/mL)混匀，37 ℃、5% CO2培养1 h，加入阻断剂布雷菲德菌素A(BFA, 1 μg/mL)，继续培养3 h，410×g离心5 min，弃上清，加入PBS重悬待测。

3. 流式细胞术检测Th17细胞比率：于流式管中加入适量FITC-抗人CD4抗体(BioLegend, Inc.，剂量参照试剂说明书)，室温暗处孵育15 min，410×g离心5 min，弃上清；加入固定剂，室温暗处孵育15 min，410×g离心5 min，弃上清；加入破膜剂，室温暗处孵育15 min；加入适量PBS，410×g离心 5 min，弃上清；加入PE-抗人IL-17A抗体(BioLegend, Inc.，剂量参照试剂说明书)，室温暗处孵育30 min；加入适量PBS，410×g离心5 min，弃上清；加入适量PBS，上流式细胞仪(Beckman Coulter FC 500)检测。Th17(%)=(CD4+IL-17+/CD4+)×100%。

4. ESR、CRP检测：外周血标本送生化实验室，采用常规方法检测ESR和血清CRP。

三、统计学分析

结果

一、外周血Th17细胞比率

流式细胞术检测结果显示，CD组外周血CD4+T细胞中的Th17细胞比率为2.51%±1.59%，UC组为4.15%±2.75%，均高于对照组的1.44%±0.73%，组间差异有统计学意义(P均<0.05)，其中UC组显著高于CD组(P<0.01)(图1)。

进一步按病情分期进行分组分析，CD活动期Th17细胞比率为3.39%±1.56%，缓解期为1.48%±0.81%，UC活动期为5.77%±2.77%，缓解期为2.18%±0.59%，活动期Th17细胞比率均显著高于缓解期(P均<0.01)(图2)。

二、活动期IBD外周血Th17细胞比率与疾病活动度的关系

Spearman秩相关系数分析显示，CD活动期外周血CD4+T细胞中的Th17细胞比率与ESR(rs=0.851,P<0.05)和CRP(rs=0.793,P<0.05)呈正相关；UC活动期Th17细胞比率亦与ESR(rs=0.817,P<0.05)和CRP(rs=0.873,P<0.05)呈正相关。

讨论

免疫功能紊乱是IBD发病的重要因素之一，效应T细胞的活化是肠黏膜免疫及其后续炎症反应的起点。现已明确，在各类T细胞亚群中，CD4+T细胞是导致肠黏膜炎症的主要效应细胞，所有结肠炎动物模型肠黏膜组织中浸润的最主要的细胞类型均为CD4+T细胞。

图1外周血CD4+T细胞中Th17细胞比率的流式细胞术检测结果

Th17细胞是一类分化机制和功能特性与Th1、Th2细胞完全不同的CD4+T细胞亚群，研究[10]指出，IL-17+T细胞与Th1、Th2细胞和Treg细胞在分化和功能上相互制约，从而维持机体免疫平衡。Th17细胞的主要效应细胞因子为IL-17，但其具体分化机制尚不十分清楚。越来越多的研究表明，Th17细胞参与了多种自身免疫性疾病的发病过程，如银屑病[1]、自身免疫性脑脊髓炎[2,4-5]、IBD[3,6-8]、类风湿关节炎[4]等。Hölttä等[6]的研究显示，活动期和缓解期CD患者黏膜固有层产生IL-17的细胞占CD4+T细胞的比率均高于对照组，肠黏膜活检组织中的IL-17A mRNA表达水平亦明显升高；而粪便IL-17含量仅在活动期CD患者中明显升高，考虑与其肠黏膜损伤有关。Rafa等[3]对CD和UC患者血浆Th17相关细胞因子mRNA的检测亦显示其表达水平显著升高。

图2　活动期与缓解期IBD患者外周血CD4+ T细胞中Th17细胞比率比较

本研究结果显示，CD和UC患者外周血CD4+T细胞中产生IL-17的Th17细胞比率均显著高于对照组，其中UC组又显著高于CD组，与Kobayashi等[7]对IBD患者肠黏膜固有层IL-17 mRNA的检测结果一致，提示尽管Th17细胞参与了这两种疾病的发生、发展过程，但在UC发病中可能起更重要的作用。Fujino等[8]的研究发现，活动期CD和UC患者病变黏膜中可检测到IL-17 mRNA表达，IL-17+细胞数量显著多于缓解期患者，本研究对CD和UC患者外周血的检测结果与之相符，表明外周血Th17细胞比率的检测可能对评估IBD疾病活动度有一定临床意义。

ESR和血清CRP能反映IBD肠黏膜炎症反应的强弱和组织损伤程度，对判断疾病临床活动度及其严重程度具有重要意义[11]。为进一步评价Th17细胞与IBD的关系，本研究分析了活动期CD和UC患者外周血CD4+T细胞中的Th17细胞比率与ESR和CRP的相关性，结果显示Th17细胞比率与ESR、CRP均呈正相关。随着肠道炎症的进展，ESR和CRP呈升高趋势，外周血Th17细胞比率同步上升，与疾病活动度相一致。

综上所述，本研究结果提示Th17细胞参与了IBD的发生、发展过程，在UC发病中的作用可能更为重要，有可能成为IBD免疫学治疗的新靶点，而检测外周血Th17细胞比率可能有助于IBD疾病活动度的评估。考虑到本研究样本量偏小，上述结论尚需扩大样本量进一步验证。

参考文献

1 Zheng Y, Danilenko DM, Valdez P, et al. Interleukin-22, a T(H)17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis[J]. Nature, 2007, 445 (7128): 648-651.

2 Sutton C, Brereton C, Keogh B, et al. A crucial role for interleukin (IL)-1 in the induction of IL-17-producing T cells that mediate autoimmune encephalomyelitis[J]. J Exp Med, 2006, 203 (7): 1685-1691.

3 Rafa H, Saoula H, Belkhelfa M, et al. IL-23/IL-17A axis correlates with the nitric oxide pathway in inflammatory bowel disease: immunomodulatory effect of retinoic acid[J]. J Interferon Cytokine Res, 2013, 33 (7): 355-368.

4 Komiyama Y, Nakae S, Matsuki T, et al. IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immunol, 2006, 177 (1): 566-573.

5 Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM, et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[J]. J Exp Med, 2005, 201(2): 233-240.

6 Hölttä V, Klemetti P, Sipponen T, et al. IL-23/IL-17 immunity as a hallmark of Crohn’s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2008, 14 (9): 1175-1184.

7 Kobayashi T, Okamoto S, Hisamatsu T, et al. IL23 differentially regulates the Th1/Th17 balance in ulcerative colitis and Crohn’s disease[J]. Gut, 2008, 57 (12): 1682-1689.

8 Fujino S, Andoh A, Bamba S, et al. Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease[J]. Gut, 2003, 52 (1): 65-70.

9 中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组. 中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J]. 中华内科杂志, 2008, 47 (1): 73-79.

10Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J]. Nat Immunol, 2005, 6 (11): 1123-1132.

11Solem CA, Loftus EV Jr, Tremaine WJ, et al. Correlation of C-reactive protein with clinical, endoscopic, histologic, and radiographic activity in inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2005, 11 (8): 707-712.

(2015-05-12收稿；2015-06-26修回)

Clinical Significance of Peripheral Blood Th17 Cells in Evaluating Disease Activity of Inflammatory Bowel DiseaseGAONan1,DAIJuan1,ZHANGGuangbo2,LIYueqin1,LIRui1,CHENWeichang1.1DepartmentofGastroenterology,2KeyLaboratoryofMedicineandClinicalImmunologyofJiangsuProvince,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006)

Correspondence to: CHEN Weichang, Email: weichangchen@126.com

Background: Th17 cells play important roles in immuno-inflammatory responses. The relationship between Th17 cells and inflammatory bowel disease (IBD) is a new hot spot of related studies. Aims: To investigate preliminarily the role of Th17 cells in the pathogenesis of IBD and the clinical significance of peripheral blood Th17 cells in evaluating disease activity. Methods: Peripheral blood mononuclear cells were collected in 81 IBD patients recruited from 5 hospitals, including 39 Crohn’s disease (CD) and 42 ulcerative colitis (UC), and also 40 healthy volunteers. The proportion of Th17 cells in peripheral blood CD4+T cells was detected with flow cytometry after stimulated by PMA and ionomycin. Simultaneously, two clinical inflammatory markers, ESR and serum CRP were measured. Results: The proportion of peripheral blood Th17 cells was significantly higher in CD group (2.51%±1.59%) and UC group (4.15%±2.75%) than in control group (1.44%±0.73%,Pall <0.05), and that in UC group was significantly higher than in CD group (P<0.01). Furthermore, the proportion of peripheral blood Th17 cells in IBD patients was significantly higher in active stage than in remission stage (CD: 3.39%±1.56%vs. 1.48%±0.81%,P<0.01; UC: 5.77%±2.77%vs. 2.18%±0.59%,P<0.01). In Spearman rank correlation coefficient analysis, the proportion of peripheral blood Th17 cells in active stage CD and UC was correlated significantly with ESR (rs=0.851, P<0.05; rs=0.817,P<0.05) and CRP (rs=0.793, P<0.05; rs=0.873,P<0.05). Conclusions: Th17 cells might be involved in the pathogenesis and development of IBD, especially UC. Measurement of the proportion of peripheral blood Th17 cells is beneficial for the evaluation of disease activity of IBD.

Key wordsInflammatory Bowel Disease;Th17 Cells;Erythrocyte Sedimentation Rate;C-Reactive Protein

通信作者&本文，Email: weichangchen@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.12.003