海南美登木提取物调节人肝癌细胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表达

宫爱民 李鑫元 杨世忠 冯 钊 (海南医学院，海南 海口 57000)

海南美登木提取物调节人肝癌细胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表达

宫爱民 李鑫元1杨世忠 冯 钊 (海南医学院，海南 海口 571000)

目的 分析海南美登木提取物调节人肝癌细胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表达。方法 应用体外细胞培养及RT-PCR法分析海南美登木提取物作用后肝癌细胞中凋亡基因p53、Fas及细胞增殖基因bcl-2表达。结果 海南美登木提取物能对人体内肿瘤细胞进行诱导和分化，并且能够有效抑制肿瘤细胞DNA合成;细胞周期G0/G1期能够有效诱导细胞凋亡;经浓度为5、10 mg/L海南美登木对提取的癌细胞进行24、36及72 h处理，可以发现很多野生型p53基因，但是未发现Fas及bcl-2基因。结论 海南美登木与患者体内诱导野生型p53基因关系密切，它能够有效清除患者体内恶变细胞，提高患者身体功能。

海南美登木提取物;p53;bcl-2基因;凋亡

人体的造血、免疫和肿瘤发生机制都受细胞凋亡的影响。Fas属于常见的肿瘤坏死因子(TNF)，它属于转移膜受体(TNF/NGF)超家族，当这种因子受到抗体及配体等刺激时，会诱导FasL死亡〔1〕。细胞在凋亡过程中p53与bcl-2基因都发挥重要作用。一方面，p53能够有效地促进细胞凋亡，而bcl-2基因则能抑制细胞的凋亡〔2〕。美登木属(Maytenus)植物主产于热带及亚热带地区〔3〕，海南美登木(M.Hainanensis)性辛、苦、温，归肝经，具有活血消癥功效，是临床上用于治疗肝癌有效的海南民族中草药，自20世纪70年代开始，相继从美登木属植物中分离提取到美登素、美登普林和美登布丁等抗肿瘤活性成分，并通过多年的实验研究及临床应用，证明其抗实验动物瘤谱广、有效剂量低、安全系数大，临床实验的结果表明美登木属植物可治疗肝癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤〔4，5〕。肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞的凋亡有密切关系，通过诱导癌细胞凋亡来治疗各种恶性肿瘤是目前研究的热点〔6〕。研究表明〔7〕:活血消癥中药抗肿瘤作用亦多从凋亡途径进行深入研究。本研究选择人肝癌HepG2细胞，观察海南美登木含提取物对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 药材、主要仪器 海南美登木，产地海南，购自万宁药用植物研究所。光学成像显微镜 (上海光学仪器厂);超净工作台(苏州安泰空气技术公司);MCO-17AICO2培养箱(日本SANYO公司);倒置显微镜 (上海光学仪器厂);酶标仪(DG3022A日本产);旋转蒸发器(DF-101S上海予正仪器设备有限公司);多功能细胞分析系统(Becton Dickinson FACSort美国产);纯水机:深圳产 SYJ-6HD400GHL;荧光显微镜 (德国Leica公司)。焦碳酸乙二脂(DEPC)，随机引物(Oligo〔dT〕15引物)，脱氧核糖核酸酶抑制剂(RNasin)，脱氧核苷三磷酸(dNTP)均为 Promega产品，反转录酶(M-MuLV reverse transcriptase)为MBI fermentas产品，TaqDNA聚合酶(5 U)、PCR扩增缓冲液为上海生工(Sangon)产品，内切酶 HincⅡ为日本(TOYOBO)公司产品，PCR热循环仪(Perkin-Elmer公司)，紫外光度仪(Amersham PharmaciaBiotech公司，Gene QuantTMⅡRNA/DNA Calculator型)。

1.2 引物序列 按文献〔8〕及GenBank库中p53基因序列设计了两条引物:p1:5′-GGTCGACTGACACGCTTCCCTGGATTGG-3′，p2:5′-GGATCCTGCTTCTGACGCACACCTATTG-3′(295 bp)。按文献〔1〕设计了 bcl-2及 Fas基因序列:bcl-2为 5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCC， 3′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTG(348 bp);Fas 为 5′-GTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC，3′-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGC(342 bp)。

1.3 主要试剂 优等胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI1640(美国Gibco公司);DMSO、MTT测定试剂盒 、Hoechst33258荧光染料 、碘化丙啶(美国Sigma公司);乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(上海信然生物科技有限公司)等。

1.4 海南美登木提取物制备 用12、10、8倍量的水分别提取20 g药物1.5、1、1 h，合并过滤后的滤液，加入 95% 乙醇，使乙醇含量达80%，弃去放置过夜的上清液，冷冻干燥所收集的沉淀，制成冻干粉〔9〕。

1.5 细胞株及培养 人源肝癌细胞HePG2，上海中医药大学肝病研究所赠予;海南医科大学病理生理实验室保存。实验中将10%灭活胎牛血清放在细胞培养皿中培养过程中放入100 mg/L青霉素以及100 mg/L链霉素，培养皿温度控制在37℃，培养过程中每3 d更换一次液体。

1.6 药物处理 用海南美登木提取物处理细胞，实验中药物浓度分别设置为5、10 mg/L，并且设对照组，药物在使用过程中对药物进行离心。

1.7 总RNA提取并反转录 对于细胞质总RNA的提取参考文献〔10〕。实验中搜集两次PBS溶液，并且在200 μl RNA中提取缓冲液，并对这些缓冲液进行离心，舍去未分裂的细胞和细胞下层的沉淀物，而离心上层则使用50 mg/L的蛋白酶K，温度控制在37℃，时间控制在30 min。然后，向分离的液体中加入1体积的水饱和酚和0.2体积的氯仿:异或醇(24∶1)对所得的液体再次进行离心，让其沉淀RNA，并在温度为-20℃下放置至少1 h，用70%的乙醇洗一遍，真空干燥并用DEPC水重溶RNA。向20 μl的反转录缓冲液中加 2 μl单链〔dT〕15引物，2.5 μl dNTP(各 10 mmol/L)，0.5 μl RNasin(1 000 U/ml)，然后，70℃加热5 min，冰上冷却。简短离心后加 1.2 μl Moloney MuLV病毒反转录酶(GIBCO公司)并37℃下保温1 h，90℃变性5 min，得到的cDNA样品保存于-70℃。

1.8 PCR的扩增 采用0.2 ml的基因中共包含以下成分，即:2.5 μl cDNA，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L 5′→3′核苷酸引物及2.5 U Taq酶(Sangon)。PCR 反应时共进行30个循环，并且在94℃时保持30 s，每一个引物退火后控制在72℃中保持2 min。对于PCR的产物在检测过程中可以使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并且设对照组。

2 结果

海南美登木提取物能够对人体内的肿瘤细胞进行诱导和分化，并且能够有效地抑制肿瘤细胞DNA的合成，并且实验结果还显示:从细胞周期的G0/G1期能够有效地诱导细胞的凋亡，实验过程中可以采用浓度为5 mg/L、10 mg/L的海南美登木处理癌细胞，对样本进行24 h、36 h及72 h检查，结果可以发现很多野生型 p53 基因(Fig.1:4、7 号泳道，Fig.2:2、3、4、5 号泳道)，但是却并没有发现 Fas及 bcl-2 等基因(Fig.1:2、3、4、5、6 号泳道，Fig.2:6、7、8、9、10、11、12、13 号泳道)。见图 1，图 2。

图1 RT-PCR分析肝癌细胞中p53，bcl-2与Fas mRNA水平(24 h)

图2 RT-PCR分析肝癌细胞中p53，bcl-2与Fas mRNA 水平(36，72 h)

3 讨论

p53基因是临床上研究较多的抑制基因，和肿瘤等有着紧密的联系。野生型p53是典型的抗肿瘤基因，但是这种物质的突变型则不但不会抑制肿瘤的发生，甚至会促进肿瘤生长而变为癌基因〔8，11，12〕。医学界普遍认为:p53基因是癌症患者中比较常见的突变基因。肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中发现并检测出了p53基因，并发现了一种新型基因bcl-2，该基因表达能力较强，能够诱发肿瘤，并且能够准确计算出肿瘤细胞的生存期〔13，14〕。

海南美登木活血化瘀，含抗癌活性成分的美登木素和美登布林有直接杀死癌细胞的作用。根据过去相关实验结果显示:海南美登木后药物能够对患者免疫起到调节作用，能够保护患者肝脏，且药物能够促进肿瘤细胞加速分化，对肿瘤细胞DNA的合成等具有较强的抑制作用。并且实验结果还显示:海南美登木从细胞周期的G0/G1期开始诱导肿瘤细胞凋亡。从这些实验等中都可以看出海南美登木提取物的作用机制和在肿瘤患者体内发挥的作用〔15〕。本实验结果显示，在肿瘤细胞凋亡过程中，基因p53表达能力会增强。但是在细胞分化和增殖过程中bcl-2等基因却没有得到表达。海南美登木提取物在p53基因中能够有效清除患者体内的癌细胞，增强患者机体免疫，但是相关机制仍然需要研究。

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3 Hideji I，Osamu S，Hiroshi I，et al.Triterpenes from maytenus ilicifolia〔J〕.Phytochemistry，1991;30(11):3713-6.

4 黄大文.美登木注射液治疗原发性肝癌20例初步报告〔J〕.广西医学，1981;13(1):9-10.

5 江苏省植物研究所.新华本草纲要〔M〕.上海:上海科学技术出版社，1990:133-5.

6 代正福，彭 明.海南中药资源名录〔M〕.北京:中国农业出版社，2009:166-7.

7 王 岚，刘建国，朱 锐，等.消瘤汤含药血清对人肝癌细胞HepG2凋亡相关因子表达的影响〔J〕.中国中西医结合消化杂志，2009;17(3):171-4.

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9 韩 盈，杨长春，张晓岚.活血化瘀药物对肝癌细胞HepG2的抑制作用及机制〔J〕.解放军药学学报，2006;22(6):401-4.

10 黄廷荣，费新应，张赤志，等，膈下逐瘀汤加减方对人肝癌细胞bax、bcl-2、P53基因表达调控的影响〔J〕.中西医结合肝病杂志，2008;18(6):355-7.

11 王厚义，黄青山.人肝癌细胞株QGY-7703的P53基因及表达研究〔J〕.细胞生物学杂志，1997;19(4):169-73.

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14 黄韧敏，袁淑兰.丹参酮诱导HL-60细胞分化及凋亡的流式细胞术分析〔J〕.中国肿瘤临床，1997;24(7):500-3.

15 Dieffenbach CW，Dveksler GS，著.种 康，瞿礼嘉，译.PCR技术试验指南〔M〕.北京:科学出版社，1999:70.

R73

A

1005-9202(2015)09-2370-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.026

海南省自然科学基金资助项目(No.811205;811207)

1 哈尔滨医科大学

杨世忠(1952-)，男，教授，博士生导师，主要从事中西医结合治疗肝胆病研究。

宫爱民(1975-)，男，主任医师，博士，主要从事中医四诊客观化、肝胆病研究。

〔2013-12-16修回〕

(编辑 苑云杰)