Kruppel样因子4在胃癌细胞中的表达及KLF4基因启动子区的生物信息学分析

杨 菁 周 力 许 钟 (贵阳医学院附属医院消化内科，贵州 贵阳 550002)

Kruppel样因子4在胃癌细胞中的表达及KLF4基因启动子区的生物信息学分析

杨 菁 周 力 许 钟 (贵阳医学院附属医院消化内科，贵州 贵阳 550002)

目的 检测Kruppel样因子KLF4基因在人胃癌细胞株MKN－45及人正常胃黏膜上皮细胞株GES－1的表达情况，并应用生物信息学方法分析KLF4基因启动子区序列，预测胃癌发生中其涉及的转录调控因子。方法 采用实时荧光定量PCR方法检测MKN－45及GES－1中KLF4 mRNA的表达;利用多种在线软件获取并分析人KLF4基因启动子序列，预测其转录因子结合位点和胃癌组织中相关的转录因子。结果 实时定量PCR检测结果显示:KLF4 mRNA在人胃癌细胞株MKN－45中的表达低于在人正常胃黏膜细胞株GES－1中的表达(4.24±0.15 vs 6.66±0.23)(P＜0.01);KLF4基因启动子序列全长为4 915 bp，共涉及183个转录因子结合位点，在胃癌中异常表达的转录因子有17个，包括AP－1、AP－2、HIF－1、SP3等。结论 KLF4 mRNA在胃癌细胞株MKN－45中表达下调，生物信息学分析提示在胃癌发生中AP－1、AP－2、HIF－1、SP3转录因子等可能参与调控KLF4的表达。

Kruppel样因子4;胃肿瘤;启动子;生物信息学

Kruppel样因子(KLF)4是真核生物中含有3个锌指结构的转录因子，在消化道组织细胞中几乎均可检测到其表达〔1〕，故又称其为胃肠富集型KLF。然而，KLF4在各消化道组织细胞中的表达程度不尽相同，且在不同的消化道组织细胞中可与不同的生物因子相互作用，因此会产生促癌或者抑癌的不同效应。大量研究表明KLF4低表达于胃癌组织细胞中〔2～4〕，由此可证明其在胃肠道肿瘤中主要起抑癌作用。但是，KLF4自身的表达调节机制至今尚未完全阐明。我们设想，能否通过基因工程方法使正常胃黏膜细胞或胃癌细胞内KLF4的表达维持在较高水平，从而延缓甚至是逆转胃癌的发生发展。基于以上设想，本研究通过实时荧光定量PCR检测KLF4在胃癌细胞株MKN－45及正常胃黏膜细胞GES－1中的表达情况，并利用生物学信息技术对人KLF4基因序列、启动子区进行分析，获得该基因启动子区转录因子结合位点，进一步筛选出胃癌中KLF4基因可能的转录调控因子，以期采用人工干预手段使KLF4基因在胃肠道正常细胞及肿瘤细胞中过表达，为后续研究提供理论指导和实验基础，为胃肠道肿瘤的预防和治疗寻求新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料、细胞株和试剂 人胃癌细胞株SGC－7901、MKN－45和人正常胃黏膜上皮细胞株 GES－1购自 ATCC细胞库;HDMEM和RPMI1640细胞培养液购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自BBI公司;青－链霉素双抗购自美国Hyclone公司;组织细胞总RNA提取试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自美国Therom公司;SYBR－Green－Kit购自大连TAKARA公司。人KLF4基因序列从美国国家生物技术信息中心在线核苷酸数据库(Gen Bank)获得。在线转录因子预测软件包含 Patch、P－Match、MatrixCatch、AliBaba2等;在线基因表达谱数据库Gene Expression Atlas。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR检测KLF4 mRNA的表达 参照组织细胞总RNA提取试剂盒说明书，严格操作后分别提取两种细胞的总RNA。以总RNA中的mRNA为模板，参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书，将mRNA反转录成cDNA，最后用实时荧光定量PCR方法检测KLF4 mRNA的表达，以GAPDH为内参照，分析产物相对表达量。KLF4上游引物为ATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGC，下 游 引 物 为 GCATCTGATCGGGCAGGAAGGAT;GAPDH上游引物为ACAACTTTGGTATCGTGGAAGGAC，下游引物为 AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG;采用2－△Ct方法分析目的基因表达的相对倍数，△Ct=目的基因Ct值－内参基因Ct值。

1.2.2 KLF4启动子区序列的获得 基于KLF4的基因序列ID，应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的链接获取启动子序列。

1.2.3 KLF4启动子区转录因子结合位点分析 通过在线启动子 区 域 预 测 分 析 软 件 PromotorScan(http://www－bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)分析启动子序列，通过转录因子数据库TRANSFAC中的在线转录因子预测软件包括Patch、P－Match、AliBaba2(http://www.gene－regulation.com/pub/programs.html)预测KLF4启动子序列顺式作用元件，分析其可能转录因子结合位点。

1.2.4 胃癌组织中相关转录因子的筛选 应用在线基因表达谱数据库Gene Expression Atlas(http://www.ebi.ac.uk/gxa/home)筛查胃癌组织中异常表达的蛋白，与预测的转录因子进行对比，获得目标转录因子。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 KLF4 mRNA在胃癌细胞系及胃黏膜上皮细胞系中的表达 实时荧光定量PCR结果显示，人胃癌细胞株MKN－45和人正常胃黏膜上皮细胞株GES－1中KLF4 mRNA表达量相对比，前者低于后者(6.66±0.23 vs 4.24±0.15，P＜0.01)。

2.2 人KLF4基因基本信息及启动子序列 人KLF4基因ID:9314，定位于9号染色体负链(9q31)，全长4 915 bp，其mRNA ID:NM_004235.4。该基因启动子 ID:HPRM23684，全长1 319 bp，位于转录起始位点－785 bp至 +534 bp之间。

2.3 人KLF4基因启动子区转录因子结合位点预测结果 应用PromotorScan分析启动子序列结果显示共57个转录因子结合位点，涉及17个转录因子，其中Sp1结合位点共22个、GCF共6个、AP－2共8个、UCE.2共4个、T－Ag共 3个。应用 Patch在线软件分析，参数设置 set of sites选择“vertebrates”，Lower score boundary设为“90”，其他采用默认设置，预测结果共1 425个转录因子结合位点，手工筛查物种为人的转录因子结合位点共562个，经汇总去重，共涉及113个转录因子。应用P－Match在线软件分析，当Cut－offs使用参数为“to minimize the sum of both error rates”时，预测到18个转录因子结合位点(图1)，去除重复共涉及9个转录因子，当使用参数为“to minimize false negative matches”，共预测到295个转录因子结合位点，经汇总去重，共涉及25个转录因子，应用AliBaba2在线软件分析，取在线软件默认设置参数，预测结果共172个转录因子结合位点，经汇总去重，共涉及52个转录因子。汇总以上软件预测结果并去除重复，结果共涉及 183 个转录因子:1－Oct、alpha－CBF、AP、AP－1、AP－2、AP－2alph、AP－2alphaA、AP－2alphaB、AP－4、APRT－mouse_US、AREB6、ARP－1、ATF、BRF1、BSAP、C/EBPal、C/EBPalp、CAC－binding、protein、CACCC－bi、CACCC－binding、factor、CAR、CBAF、CBF－B、CBTF、CDP CR3、CDP2、c－Ets－1、c－Ets－2、CF1、c－Fos、c－J、c－Jun、Clox、c－Myb、c－Myc、CP1、CP1A、CP2、CPE_bind、CRE、CREB、CRE－BP1、c－Rel、CTCF、CTF、CUTL1、E1、E2、E2F+p107、E47、EARLY－SEQ1、EGR－1、Elk－1、ER、ER－alpha、ETF、Evi－1、EZF－2、FOR1、FOR2、Fra－1、FXR、gammaCAAT、gammaCAC1、gammaCAC2、GATA－1、GCF、GCN4、GGCGG、GLI3、GLO、GR、GTCAC、H1TF2、H4TF1、H4TF－2、HFH－1、HIF－1、HiNFD、HiNF－M、HiNF－P、HNF－1A、HNF－1B、HNF－1C、HNF－3alpha、HNF－3B、Hp55、Hp65、ISGF－3、JCV_repeated_sequenc、Krox－20、KROX24、LEF－1、LF－A1、LUN－1、LXR－alpha、LXR－beta、MAF、MafG、Max、Max1、MAZ、MEB－1、MIG1、MLTF、MTF－1、MT－I.6、MyoD、myogenin/NF－1、MZF－1、NF－1、NF－1/L、NFAT－1、NF－ATp、NF－E、NF－E2、NF－E3、NF－kappaB、NF－muE1、NF－S、NIP、Nkx2－5、NRF－2Oct－1A、p58、Pax－2、Pax－5、Pax－8、PEA3、PEBP2alphaA1、POU1F1a、PPUR、PuF、PXR－1、R、RAP1、RAR－alph、RAR－alpha1、RAR－beta、RAR－beta2、RAR－gamma、REB1、Ref－1、represso、RFX2、RREB－1、RSRFC4、RXR－alpha、RXR－beta、RXR－gamma、SDR_RS、SMAD－3、SMAD－4、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、SRF、STATx、SXR、T3R、T3R－alpha、T3R－beta1、T3R－beta2、T－Ag、Tax/CREB、TBP、TEC1、TFIID、TMF、TR2－11、UCE.2、USF、USF1、USF2、VDR、v－ErbA、v－Jun、WT1、XBP－1、XFD－2、YY1、ZID。

图1 P-Match分析KLF4启动子区顺式作用元件

2.4 筛查胃癌中人KLF4启动子区可能转录因子 应用在线基因表达谱数据库Gene Expression Atlas检索胃癌中异常表达的蛋白结果共3 249个，与上述预测的183个转录因子进行对比，取交集获得目标转录因子。结果预测的转录因子中共有17个在胃癌中异常表达:AP－1、AP－2、AP－4、ATF、CTCF、FXR、HIF－1、LEF－1、NF－1、Pax－5、Pax－8、RREB－1、SMAD－4、SP3、SRF、USF1、YY1。

3 讨论

伴随着人类基因组计划(HGP)的成功，特别是进入到后基因组计划(Post－HGP)时代，对基因的功能研究已成为热点之一。本课题所研究的KLF4基因是真核生物中的锌指蛋白转录因子，属于锌指蛋白Kruppel家族，位于9q31染色体，含有5个外显子，其cDNA编码含470个氨基酸的蛋白，其开放读码框包括转录激活域、转录抑制域、锌指DNA结合域、核定位信号和潜在PEST序列〔5〕。KLF4基因在细胞增殖、分化、迁移、炎症中具有调控作用。除此之外，KLF4基因作为胃肠富集型KLF，与消化道肿瘤的发生、发展密切相关。本课题选择MKN－45和GES－1两种消化道组织细胞作为研究载体，通过对比检测两种细胞中KLF4基因表达情况，提示KLF4基因的表达水平与组织的癌性呈负相关趋势。Jiang等〔6〕应用免疫组织化学法分析不同分期的胃癌组织后显示，KLF4蛋白高表达于正常胃组织和癌旁组织，低表达于胃上皮瘤变组织，而在胃肿瘤组织中几乎无表达，且随着胃癌分期的递增，KLF4的表达逐渐减弱。亦有学者通过实验研究表明KLF4表达率与肿瘤临床分期、浸润深度、淋巴结转移等存在显著地负相关特性〔7，8〕。细胞质内高表达KLF4基因的胃癌患者与低表达KLF4基因的胃癌患者相比，前者明显表现出更高的总生存率〔9〕，以上现象说明 KLF4的高表达可产生一定的抑癌作用。

本研究发现人胃癌细胞株MKN－45的KLF4 mRNA表达明显低于人正常胃黏膜细胞GES－1中KLF4 mRNA的表达，这一点印证了KLF4基因在癌性组织中低表达这一现象。与此同时，胃正常组织与癌变组织中的KLF4定量检测增添了数据支持;另一方面，也为本课题后续的关于KLF4基因启动子区调控干预实验提供相应的研究支持，乃至于为今后以期利用MKN－45作为研究对象的研究人员提供实验参考依据。但是由于本课题仅选用一种胃癌细胞(MKN－45)与正常人胃黏膜细胞(GES－1)做对比，结果具有一定局限性，是否存在其他更为典型、更为有意义的参照细胞，相信随着研究深入会被发现与认知。

目前，生物信息学分析方法被广泛应用于基因的转录、调控等方向研究。应用生物信息学方法预测KLF4基因可能的调控元件，具有高效、经济的等优点，对进一步阐释该基因的功能等研究工作具有重要作用。本研究中我们预测了KFL4基因启动子区相关转录因子共183个，人胃癌KLF4基因启动子区可能的转录因子17个。这就为拟在KLF4启动子区作出相关研究的人员提供一个较明确的方向，从而可以利用该生物信息学分析所得出的结果，进行实验设计等研究工作，起到事半功倍的效果。国外相关研究报道，在KLF4基因5′侧翼区核苷酸序列中存在AP－1的结合位点，且KLF4基因受转录因子 AP－2、SP3 调控〔10，11〕;在缺氧情况下，KLF4 的表达下调表达受 HIF－1α依赖方式调控〔12〕。这些数据均为我们的预测提供了支持证据，对进一步的研究提供了理论基础。与此同时，相信我们的研究成果亦可为广大从事KLF4基因研究的相关人员提供理论及数据上的参考。虽然关于KLF4基因启动子区相关转录因子的预测与实际情况可能会出现一定的偏差，进一步的验证过程不仅需要生物信息数据库进行持续的更新与改进，也需要广大的研究人员不断提供相应的研究成果来一一佐证。我们应充分重视生物信息学分析方法的作用，利用该方法尽可能地挖掘国内外已有研究成果，从而有效缩小研究范围，有助于进一步研究在胃癌发生过程中抑癌基因KLF4的转录、调控等作用机制，为肿瘤的预测、预防及靶向治疗提供探索方向和实验基础。

综上所述，本文再次证实KLF4与胃癌的负相关，同时为下一步的深入研究奠定了基础。通过运用生物信息学分析方法预测KLF4基因的启动子区相关调控因子，利用该分析结果指导对KLF4基因转录调控机制的探究，试图在今后的研究中阐释KLF4基因与消化道肿瘤疾病发生、发展的关系以及在其中的具体作用。着力于基因层面及分子水平为消化道肿瘤疾病的预防与治疗提供新的思路与方向。

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5 Wei D，Kanai M，Huang S，et al.Emerging role of KLF4 in human gastrointestinal cancer〔J〕.Carcinogenesis，2006;27(1):23－31.

6 Jiang K，Ren C，Nair VD.MicroRNA－137 represses Klf4 and Tbx3 during differentiation of mouse embryonic stem cells〔J〕.Stem Cell Res，2013;11(3):1299－313.

7 Yang WT，Zheng PS.Krüppel－like factor 4 functions as a tumor suppressor in cervical carcinoma〔J〕.Cancer，2012;118(15):3691－702.

8 Zhao W，Hisamuddin IM，Nandan MO，et al.Identification of Kruppellike factor 4 as a potential tumor suppressor gene in colorectal cancer〔J〕.Oncogene，2004;23(2):395－402.

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10 Mahatan CS，Kaestner KH，Geiman DE，et al.Characterization of the structure and regulation of the murine gene encoding gut－enriched Krüppel－like factor(Krüppel－like factor 4)〔J〕.Nucl Acid Res，1999;27(23):4562－9.

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Expression of tumor suppressor gene KLF4 in gastric cancer cells and bioinformatics analysis on promoter region of KLF4

YANG Jing，ZHOU Li，XU Zhong.
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang 550002，Guizhou，China

ObjectiveTo explore the expression of KLF4 gene in human gastric cancer cell lines MKN－45 and analyze the gene sequence of KLF4 promoter region in gastric cancer.Methods Real－time PCR was used to detect KLF4 mRNA expression in MKN－45 and GES－1.A variety of online software were used to analyze the sequences of KLF4 gene promoter and predict the binding sites of transcriptional factor and relevant transcription factors in gastric cancer.Results Real－time PCR showed that the KLF4 mRNA level in MKN－45 was significantly lower than that of GES－1(4.24±0.15 vs 6.66±0.23)with significant differences(P＜0.01).The promoter region of KLF4 gene was 4 915 bp long，containing 183 transcriptional factors.Among them，17 transcriptional factors were abnormally expressed in gastric cancer，including AP－1，AP－2，HIF－1，SP3，etc.Conclusions KLF4 mRNA expression is down－regulated in gastric cancer cell line MKN－45.Bioinformatics analysis shows that transcriptional factors AP－1，AP－2，HIF－1 and SP3 may be involved in regulation of KLF4 expression in the development of gastric cancer，which provides theoretical basis for further research.

Kruppel like factor(KLF)4;Gastric cancer;Promoter;Bioinformatics

R73

A

1005-9202(2015)09-2350-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.018

贵州省科学技术基金项目(No.〔2012〕2240)

周 力(1956－)，男，硕士，主任医师，主要从事消化内科相关疾病研究。

杨 菁(1986－)，女，硕士在读，主要从事消化内科相关疾病研究。

〔2013－12－09 修回〕

(编辑 安冉冉/曹梦园)