神经根回植联合细胞移植治疗大鼠臂丛神经根性撕脱伤的作用

李晓涛 李长德 解云川 孙国娟 (佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

神经根回植联合细胞移植治疗大鼠臂丛神经根性撕脱伤的作用

李晓涛 李长德 解云川 孙国娟 (佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的 研究神经根回植联合细胞移植治疗大鼠臂丛神经根性撕脱伤的治疗作用。方法 随机将实验大鼠分成3组:A组(颈神经根撕脱组)、B组(颈神经根撕脱后回植组)、C组〔颈神经根撕脱后回植联合神经干细胞(NSCs)与雪旺细胞(SCs)移植组〕;于术后不同时间点观察实验大鼠患肢功能恢复情况及相应脊髓损伤节段前角运动神经元的存活率。结果 术后1～8 w，B、C组患肢活动功能恢复情况较A组明显改善;各组脊髓前角运动神经元存活率比较:A组＜B组＜C组，组间进行两两比较有显著性差异(P＜0.05)。结论 神经根回植术联合细胞移植能够改善受伤大鼠的患肢功能，对损伤局部的神经元提供支持、保护和营养作用，可以挽救局部濒死的神经元，减少损伤局部细胞的死亡。

神经干细胞;雪旺细胞;移植;臂丛神经

交通伤、高空坠落等高能量创伤较以往有大幅度增长，上臂丛神经根性撕脱伤患者上肢的功能将不同程度的丧失，以往临床上多采取撕脱的神经根回植或其他神经移位等手术方法治疗伤者，但疗效一般。上世纪末，人们发现神经干细胞(NSCs)具有分化的潜能，这改变了之前的人们对中枢神经系统神经细胞不可再生的认识，也给为人们利用NSCs的移植治疗神经系统疾病提供了新的思路。雪旺细胞(SCs)是周围神经的胶质细胞，其功能活跃，能分泌多种神经营养因子，对周围神经的生长、发育及功能的保持起到重要作用。当周围神经损伤后，其对于神经的再生与修复也起到至关重要的作用。本研究通过实验观察NSCs与SCs共移植对臂丛神经根性撕脱伤大鼠患肢功能的影响以及损伤局部神经元的存活情况，综合评价细胞移植的疗效，进而阐明细胞移植治疗作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠60只，鼠龄(60±5)d，体重(250±20)g，健康清洁级，随机分为3组，每组20只，A组(颈神经根撕脱组)、B组(颈神经根撕脱后回植组)、C组(颈神经根撕脱后回植联合NSCs与SCs移植组)。

1.2 主要试剂 DMEM/F12、B27(Gibco公司)，小鼠抗大鼠BrdU抗体、小鼠抗大鼠Nestin抗体、FITC标记羊多克隆抗体(Sigma公司)，S-100抗体、鼠抗大鼠GFAP抗体、小鼠抗大鼠MAP-2抗体 、SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)。

1.3 实验方法 A、B、C组均制备成臂丛神经根性撕脱伤模型，手术方法参照朱清远等〔1〕的制备方法。方法如下:取颈椎后正中切口，依次切开皮肤、皮下组织及深筋膜，以C2及C7棘突确定椎体及神经根次序，沿中线向右侧或左侧分离棘突旁肌肉组织，手术显微镜下显露硬脊膜和固定C5、C6、C7神经根，将C5、C6、C7神经根予以撕脱，操作应轻柔，然后将C6神经根残端标记后埋于棘突旁肌肉组织内，再将撕脱的C5、C7神经根剪除1.5～2.0 mm后分别予以旷置。大鼠模型制备后1 w，A组局部显露后注入与移植细胞同体积的生理盐水;B组行神经根回植术并局部注入与移植细胞同体积的生理盐水;C组行神经根回植及细胞移植术。神经根回植方法如下:沿原手术切口切开皮肤、皮下组织及深筋膜，以C2及C7棘突确定椎体及神经根次序，分离棘突旁组织，手术显微镜下将C6神经根断端修整后插入相应节段颈髓硬脊膜下约0.8～1.0 mm深处，行神经外膜缝合。C组还要在神经根回植后行细胞移植。细胞移植方法如下:取微量注射器沿C6神经根的回植部位刺入脊髓，深度约1.0～1.5 mm。A组和B组注入5 μl生理盐水，C组移植入Brdu标记后的5 μl NSCs和5 μl SCs。缓慢地将细胞悬液注入上述移植部位，注射速度为0.8～1.0 μl/min，细胞悬液中细胞密度约为1.0×106/μl。术后给予抗生素预防感染。于不同时间点观察、记录实验动物患肢功能恢复情况、利用HE染色法计算大鼠相应脊髓损伤节段前角运动神经元的存活率。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 大体功能评价 术后1 w左右，可见少数大鼠开始出现手术侧肘关节的屈曲动作，但大多数大鼠的活动幅度小于30°;随着恢复时间的延长，大鼠手术侧肘关节的屈曲动作有所恢复，至术后4～8 w时，B、C组手术侧肘关节的屈曲功能恢复情况明显优于A组，B、C组部分大鼠手术侧肘关节的屈曲功能恢复至30°～60°，C组还有2只手术侧肘关节的屈曲功能恢复至60°～90°。见表1。

2.2 脊髓前角运动神经元存活率的检测 术后各时间点A组与其他两组神经元存活率有显著性差异(P＜0.05);B组C组有显著性差异(P＜0.05)。见表2。

表1 各组患侧肢体屈曲功能情况(n=20，n)

表2 各组脊髓前角运动神经元存活率(%，±s，n=3)

表2 各组脊髓前角运动神经元存活率(%，±s，n=3)

与A组比较:1)P＜0.05;与B组比较:2)P＜0.05

组别1 w 2 w 4 w 8 w A组50.1±4.2 40.8±3.4 34.3±2.2 21.4±1.5 B 组 66.3±4.11) 52.4±3.11) 41.5±2.81) 38.1±2.41)C 组 78.1±5.21)2)76.4±3.41)2)73.2±3.11)2)68.3±2.21)2)

3 讨论

臂丛神经根性撕脱伤是神经根的轴突在靠近细胞体处断裂，神经根远端开始发生Waller变性，另外受损的神经随之发生逆向性变性，引起脊髓相应节段的神经元死亡，结果导致患侧肢体出现严重的功能障碍，预后差。这需要临床医生与细胞生物学等相关学科的研究人员紧密配合，采取综合性的治疗手段〔2，3〕。以神经回植重建神经通路的连续性，再移植 NSCs与SCs用以激活损伤区域周围处于休眠状态的神经元，移植的细胞还能够弥补局部缺失的神经元，保护、挽救受伤的神经元，以达到改善局部微环境、促进神经轴突的再生、神经元数量的恢复，最终使实验动物的患肢功能得以改善。

对于建立臂丛神经根性撕脱伤动物模型，国内外学者所采取的方法不尽相同。Yamada等〔4〕采用神经移位的方法利用同侧C3、C4神经根来修复损伤的C5、C6神经根，效果较好。本文采用经颈后正中切口，沿棘突旁作颈后肌群骨膜下剥离，切除一侧半椎板，显露椎管内、外神经根结构，采取切断大鼠C5、C6、C7神经根，再把神经根近端撕脱，术后定期进行电生理学及肌肉功能等方面检测，结果表明:上述制备臂丛神经根性撕脱伤动物的方法令人满意。此方法的优点是手术操作相对简单，术区出血少，术野清晰，不易损伤重要组织结构，神经根及脊髓显露充分。本实验表明:治疗臂丛神经根性撕脱伤，神经回植术是局部修复的基础，而细胞移植对于损伤的修复具有重要意义。

Nakamura等〔5〕把经体外扩增的人NSCs用TP标记后移植到臂丛根性撕脱伤猕猴的相应脊髓节段内，结果发现人的NSCs可以在猕猴体内存活、迁移，并且有部分细胞进行了分化，还观察到猕猴患侧上肢运动功能明显优于对照组。本实验提示，SCs对NSCs有支持、保护及营养作用，其在局部所形成的微环境更促进NSCs分化为有功能的神经元。本实验说明在神经根回植术联合NSCs与SCs移植能够起到对损伤局部神经元的保护作用。

利用NSCs和SCs共移植治疗臂丛神经根性撕脱伤的确切机制虽然还不甚明了，可能与下列因素有关:①通过神经根回植术，恢复损伤神经组织的解剖结构，修复受损的神经通路;②植入的NSCs在局部存活并产生诸如多肽类、神经营养因子类等细胞因子，这些细胞因子可以促进局部损伤神经组织的修复;③SCs与NSCs的共移植，SCs为NSCs提供生长、发育所需要的骨架，为NSCs提供生长所必需的多种神经营养因子。此外，SCs还能参与构成有利于NSCs向功能神经元方向分化的微环境。

1 朱清远，王玉发，王国君，等.臂丛神经根性撕脱伤动物模型的实验研究〔J〕.吉林医学，2003;24(2):133-5.

2 Reinebrant HE，Wixey JA，Gobe GC，et al.Differential effects of neonatal hypoxic-ischemic brain injury on brainstem serotonergic raphe nuclei〔J〕.Brain Res，2010;1322:124-33.

3 Naghdi M，Tiraihi T，Namin SA，et al.Transdifferentiation of bone marrow stromal cells into cholinergic neuronal phenotype:a potential source for cell therapy in spinal cord injury〔J〕.Cytotherapy，2009;11(2):137-52.

4 Yamada S，Peterson GM，Soloniuk D，et al.Coaptation of the anterior rami of C3 and C4 to the upper trunk of the brachial plexus for cervical nerve root avulsion〔J〕.J Neurosurg，1991;74(2):171-7.

5 Nakamura M，Toyama Y，Okano H.Transplantation of neural stem cells for spinal cord injury〔J〕.Rinsho Shinkeigaku，2005;45(11):874-6.

R74

A

1005-9202(2015)09-2331-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.011

黑龙江省自然科学基金(H201359);黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521538)

孙国娟(1976-)，女，主管护师，主要从事脊柱外科患者围术期护理的研究。

李晓涛(1974-)，男，博士，副主任医师，主要从事周围神经损伤与修复研究。

〔2013-12-19修回〕

(编辑 张 慧)