多重调理吞噬试验方法的重复性和再现性研究

李江姣 杜慧竟 石继春 陈翠萍 徐 苗 叶 强

中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050

肺炎球菌疫苗的保护力可以通过临床效力试验来确定[1]，但由于需要的样本量大、费用高、周期长等原因临床效力试验往往不易实施。建立与肺炎球菌疫苗保护力相关联的实验室检测手段，使用血清学检测结果作为观察终点，能够协助疫苗效力试验评估肺炎球菌疫苗的保护力，大大缩短周期。通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）进行的荚膜多糖特异性IgG抗体的定量测定，是目前比较成熟的在婴幼儿新型肺炎球菌疫苗审批中使用的临床效力评价方法[2]。而由于成人存在交叉反应抗体，用ELISA法检测的IgG抗体特异性较低[3]，因此人们试图寻找特异性高并与疫苗保护力相关性更高的替代试验。

相比ELISA方法，体外调理吞噬试验（Opsonop-hagocytic assay，OPA）可以反映机体抵御肺炎球菌感染的体内机制[4-5]，其结果能更加真实地反映肺炎球菌疫苗的保护效力[6-7]，因此OPA技术在国际疫苗监管体系中受到越来越多的重视，并得到了不断的发展和优化。随着OPA技术的发展，一些实验室改用HL-60细胞作为效应细胞，代替外周血淋巴细胞，并对试剂和试验步骤进行优化。在此基础上，美国阿拉巴马大学肺炎链球菌血清学参比实验室研发的多重调理吞噬实验技术（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA）能够同时进行4个血清型的功能抗体检测，极大提高了多价疫苗的检测效率，促进了该项技术的推广应用[8]。然而由于操作相对复杂，技术要求高，我国长期以来对该方法的研究和应用均较缺乏。为了提升我国药检机构对肺炎球菌疫苗的免疫效果评价水平，本研究组前期已经成功建立起MOPA技术[9]，利用该技术对13价肺炎球菌结合疫苗免疫后的12份婴儿血清样本进行了OPA滴度检测，并与相应的ELISA结果进行了比较分析，结果显示，OPA法与ELISA法测定的血清抗体效价的相关性较高，二者结果具有良好的一致性[10]。

为了进一步对所建立的MOPA技术进行验证，本研究在两个不同实验室[中国食品药品检定研究院（以下简称“我院”）及该技术的发明单位美国阿拉巴马大学肺炎球菌血清学参比实验室]利用MOPA技术对同一组血清样本（19份血清）针对13个血清型肺炎球菌的OPA滴度分别进行了两轮MOPA检测，并对两实验室间结果及我院内的两轮结果进行了比较分析，旨在通过与国际参比实验室的比较来检验我们建立的MOPA方法的重复性（我院内比较）和再现性（两个实验室间比较），进而为我国药检机构应用该技术进行肺炎球菌疫苗免疫效力评价的可靠性提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HL-60 细胞系购自美国 ATCC（CCL-240）；13 种血清型的肺炎链球菌靶菌、19份血清样本、以及乳兔补体来源于美国阿拉巴马大学肺炎链球菌血清学参比实验室。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 我院使用的试剂及仪器 二甲基甲酰胺（DMF）（批号：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（批号：2532B313）、链霉素（Streptomycin，批号：2036B318）购自美国梭伦Amresco公司；奥普脱欣（Optochin，批号：051M1257V）、奇 霉 素 （Spectinomycin， 批 号 ：102K05 447V）、甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim，批号：BCBC9232V）购于美国圣路易斯Sigma公司；菌落计数器 （型号：ProtoCOL 3）购自英国剑桥Synbiosis公司。

1.2.2 美国阿拉巴马大学肺炎链球菌血清学参比实验室使用的试剂及仪器 DMF（批号：107575）购自美国匹兹堡 Fisher Scientific公司；TTC（批号：BCBP3272V）、链霉素（Streptomycin，批号：SLBH9702V）、奥普脱欣（Optochin，批号：051M1269V）、奇霉素（Spectinomycin，批号：102K05782V）、甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim，批号：BCBN2518V）购于美国圣路易斯Sigma公司；菌落计数器（型号：ProtoCOL 3）购自英国剑桥Synbiosis公司。

1.3 OPA滴度检测

OPA滴度检测采用可同时检测4种血清型的多重调理吞噬实验方法（MOPA法）。具体操作步骤见参考文献[9-10]。我院及美国阿拉巴马大学肺炎链球菌血清学参比实验室对19份血清样本的13个血清型分别进行两轮MOPA检测，每轮MOPA试验中的每个血清样本均平行测定2次，取平均值作为每轮试验的结果值。

1.4 结果分析

进行两实验室间的结果比较时，取各自实验室两轮MOPA试验结果的平均值作为各自实验室的最终结果值。将OPA滴度值转换为以10为底的对数，进行线性回归分析，计算相关系数。

2 结果

19份血清样本针对13个血清型肺炎球菌的OPA滴度在两实验室间及我院内的比较结果见图1（封三）。图1可以看出，两实验室间比较及我院内比较产生的点均大部分集中聚集在一致线上及其附近，提示结果有着良好一致性。实验室间比较的点相较与实验室内比较的点分布稍微分散。19份血清样本针对13个血清型肺炎球菌的OPA滴度在两实验室间及本室两轮试验的相关系数统计结果具体见表1。

3 讨论

特异性抗体、补体与吞噬细胞表面结合，促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的过程称为调理吞噬作用，是人类宿主抵抗肺炎球菌感染的主要机制[4]。由于OPA技术可以直接测定具有调理吞噬功能的功能性抗体水平[5]，并且与肺炎球菌疫苗免疫保护效力的相关性比ELISA法更高[6-7]，因而OPA技术在国际上受到越来越多的关注和应用[11-15]。2013年美国惠氏公司的13价肺炎球菌结合疫苗在欧洲被批准用于50岁以上成人使用时，采用OPA技术进行临床效果评价[16-17]。2015年美国默沙东公司新注册的的15价肺炎球菌结合疫苗使用OPA法进行临床评价[18]。

表1 MOPA实验比较结果的相关系数

然而，由于OPA试验操作相对复杂，对实验室条件及操作人员专业技术要求高，因而其大范围的推广应用受到了一定程度限制。OPA试验中涉及的活性物质较多，需要经过反复摸索逐渐掌握。首先，效应细胞是OPA实验中一个重要部分，也是比较难于掌控的一个环节。许多实验室在建立OPA技术时遇到的主要障碍来自HL-60细胞的操作。因为该方法不仅要求实验室具备细胞培养能力，还得确保HL-60细胞能够有效分化为中性粒细胞样吞噬细胞。诱导剂DMF的浓度、细胞分化时间以及用于分化的细胞数量都需严格控制。其次，该方法中各血清型的活性靶菌数均需控制在70～180 cfu范围内以保证计数数据的准确性，而实验中各种原因常常导致靶菌数量波动和超出范围，容易导致试验失败。再次，本方法对补体的要求也比较高，要求补体自身的非特异性杀菌力不能太强，需经过筛选。正由于该方法试验操作复杂，技术性要求高，目前在国内的发展和应用仍比较缺乏。为了促进该技术在国内的应用，我院前期构建了该技术所需的HL-60主代细胞库、13种血清型的工作菌种批，完成了相应的有效性检测，最终成功建立起MOPA技术[9]。随后利用建立的MOPA技术完成了12份血清样本的13种血清型的OPA滴度检测，并与相应的ELISA结果进行了比较分析，得到较高的一致性结果[10]。

为了进一步对所建立的MOPA技术进行验证，本研究组利用MOPA技术对19份血清样本针对13个血清型肺炎球菌的OPA滴度在两个实验室（我院和美国阿拉巴马大学MOPA技术发明实验室）分别进行了两轮检测，并对两实验室间结果及我院内两轮结果进行比较分析，通过与国际权威参比实验室的结果比较来检验建立的MOPA技术的再现性和重复性。本研究结果显示：全部13个血清型的总的实验室间和总的实验室内相关系数均较高，分别为0.94和0.96。各血清型的实验室间和实验室内相关系数范围分别为0.87～0.99 和 0.68～0.99。 1、3、5、6A、6B 型在两实验室间测定的OPA滴度相关性很高，其中1、5型的两实验室间相关性最高，均为0.99。4型和9V型在两实验室间相关性相对略低，分别为0.87和0.88。9V型在我院内两次OPA结果相关系数偏低，可能是由于两次实验中所用效应细胞的分化状态不同导致。总体上看，13个血清型的总实验室内相关系数高于总实验室间相关系数；各血清型分开来看，多个型别的实验室内相关系数小于实验室间相关系数，可能由于两实验室间进行比较的数值是各自实验室两轮OPA试验的平均值，结果值更为准确一些。国际上有过6个实验室同时用OPA法检测16份血清样本的研究，得出实验室间相关系数范围为0.71～0.91[19]。本研究证实我院建立的MOPA方法具有良好的重复性和再现性，不低于国际同等水平。

综上所述，本研究证明所建立的MOPA方法具有良好的重复性和再现性。未来还将对建立的MOPA方法做更多的验证，如特异性、精密性等，以逐步完善该方法的整体验证，最终为该技术成功应用于肺炎球菌疫苗的临床免疫效果评价，并为实现在我国药检机构的推广提供基础。

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