口服头孢菌素类药物对肺炎链球菌肺炎大鼠肠道菌群的影响

尹 梅 刘振国 孟静茹 侯 征 马 雪

1.西安市儿童医院特需科，陕西西安 710003；2.西北妇女儿童医院药剂科，陕西西安 710061；3.第四军医大学药理学教研室，陕西西安 710032

肺炎链球菌是儿童社区获得性感染的重要病原菌[1]，也是引起儿童呼吸道感染的常见致病菌，还可导致儿童中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、菌血症及败血症等，具有很高的感染率和病死率[2]。根据WHO数据显示，全球每年约160万人死于肺炎链球菌感染，其中5岁以下儿童达100万，90%以上死亡病例在发展中国家[3]。青霉素是肺炎链球菌感染的首选治疗药物，广泛应用于肺炎链球菌感染的治疗，但近年来耐药情况日趋严峻[4]。目前，儿科临床上常用口服头孢菌素治疗肺炎链球菌感染，但部分研究者认为在应用抗菌药物治疗过程中会干扰肠道菌群的定植，抑制机体益生菌，导致少数条件致病菌的易位和耐药性的产生[5-6]。本实验通过建立肺炎链球菌感染大鼠肺炎模型，研究临床常用口服头孢菌素（头孢克洛、头孢地尼和头孢克肟）对感染大鼠肠道菌群的影响，进一步探讨其对某些细菌的耐药性，为儿科临床实践中合理应用抗生素提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，50只，体重250～300 g，由第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（军）2012-006。饲养环境：温度（23.0±2.0）℃，湿度（55±5）%，光照 7∶00～19∶00。动物进行适应性训练1周后使用。

1.2 菌株及药品

1.2.1 致病菌株 选取西安市儿童医院2014年2～4月住院22～26个月患儿咽拭子标本，经培养鉴定筛选获得肺炎链球菌（编号：SP14021a）。将分离获得的临床菌株SP14021a在感染动物前接种于Muller-Hinton琼脂（MHA）平板中，37℃过夜培养，转接于MH肉汤培养基，37℃孵育至对数生长期，即为实验所用菌液。将细菌原液离心（12000 r/min离心2 min）后，用无菌生理盐水重悬稀释后配制成细菌混悬液，用比浊仪调节混悬液的最终浓度为1.5×109备用。

1.2.2 药品与试剂 头孢克洛干混悬剂（希刻劳，0.125g/袋，礼来苏州制药有限公司，批号C354375），头孢地尼分散片（达力先，0.1 g/片，深圳致君制药有限公司，批号A140203），头孢克肟颗粒（达力芬，50 mg/包，深圳致君制药有限公司，批号A20131016），由西北妇女儿童医院药剂科提供。

1.3 动物分组

50只大鼠随机分为5组，每组10只，随机选取一组作为正常对照组，其余四组复制肺炎链球菌感染大鼠肺炎模型，造模成功后再随机分为感染后未治疗组、头孢克洛组、头孢地尼组和头孢克肟组，各组给药剂量均根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表换算，分别采用灌胃方法给予头孢克洛（100 mg/kg）、头孢地尼（30 mg/kg）和头孢克肟（45 mg/kg），正常对照组和肺炎链球菌肺炎模型组分别给予生理盐水灌胃，每日2次，连续给药5 d。

1.4 复制动物模型

采用腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，参照文献[7]方法，将大鼠麻醉后仰卧固定于实验台，撑开大鼠口腔，充分暴露咽喉部，用连接注射器的钝圆针头经口缓慢插入气管，通过微量注射器缓慢注入菌液40 μL（细菌浓度 5×108cfu/mL），使菌液直接进入大鼠肺内。正常对照组在同一时间用同样方法注入等量的无菌生理盐水。

1.5 粪便涂片

治疗结束后留取各组大鼠粪便标本进行快速薄层涂片、固定，采用改良革兰染色后镜检，每张涂片分别计数3个随机油镜视野下的革兰阳性杆菌（G+杆菌）、革兰阴性杆菌（G-杆菌）、革兰阳性球菌（G+球菌）、革兰阴性球菌（G-球菌）数量，计算百分比。

1.6 肠道菌群分析

各组动物处理后24 h麻醉取材。大鼠麻醉后仰卧固定于手术台上，腹部脱毛后常规消毒皮肤，无菌条件下打开腹腔，切开大肠肠壁，取内容物约0.5 g，加生理盐水10倍稀释作为原液，取原液进行1∶10、1∶100、1∶1000 倍比稀释， 分别取 100 μL 稀释液用玻璃涂布棒均匀涂布于不同菌群的培养平板中，包括血琼脂平板、麦康凯平板、肠球菌平板和念珠菌显色平板。血琼脂平板主要用于培养肠道弯曲菌、幽门螺杆菌等，麦康凯平板主要用于培养革兰阴性肠道杆菌，肠球菌平板主要用于培养肠球菌，念珠菌显色平板主要用于真菌培养。各标本每个浓度的稀释液分别做3个平板，置于37℃CO2培养箱中培养，其中血琼脂平板、麦康凯平板、肠球菌平板培养24 h，选择性培养肠杆菌及肠球菌；乳酸杆菌选择培养基MRS平板、念珠菌显色平板培养48 h，选择性培养乳酸杆菌及念珠菌。统计各平板菌落数并计算各梯度的菌落平均数。根据下列公式进行细菌定量分析：组织细菌含量[cfu/g（mL）]=菌落数×稀释倍数/组织重量。各类细菌根据革兰染色和菌落形态进行初步鉴定，再由细菌自动分析仪进行菌落鉴定。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 头孢菌素对肺炎链球菌感染大鼠肠道菌群比例的影响

与正常对照组相比，感染后未治疗组中G+杆菌和G-球菌占肠道细菌总数比例明显降低（P<0.01或P<0.05），G-杆菌及G+球菌占细菌总数比例明显升高（P<0.01或P<0.05）。与正常对照组相比，应用三种头孢菌素类药物治疗后G+杆菌比例均明显降低 （P<0.01 或 P<0.05），G-杆菌比例明显升高（P<0.05），G-球菌比例无显著性变化。与正常对照组相比，应用头孢克洛可导致G+球菌比例明显升高（P<0.05），但应用头孢地尼和头孢克肟后G+球菌比例未见显著性变化（P>0.05）。与感染后未治疗组相比，应用头孢克洛治疗5 d后肠道内G-杆菌比例虽下降，但差异无统计学意义 （P>0.05），G-球菌占细菌总数比例明显升高（P<0.05），其余肠道细菌比例无显著性变化。与感染后未治疗组相比，应用头孢地尼治疗5 d后肠道内G+球菌比例下降，G-球菌比例升高（P<0.05）。与感染后未治疗组相比，应用头孢克肟治疗5 d后肠道内G+杆菌占细菌总数比例升高 （P<0.05），G-杆菌和G+球菌比例降低（P<0.05）。见表1。

表1 头孢菌素对肠道各菌群数占总菌群数比例的影响（%， ±s）

表1 头孢菌素对肠道各菌群数占总菌群数比例的影响（%， ±s）

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与未治疗组比较，#P<0.05

58.72±4.22 33.38±3.73**35.28±4.06**41.55±2.18**45.63±3.54*#35.14±1.85 58.07±4.27**55.66±4.14*50.23±3.95*48.14±4.32*#5.08±1.06 8.02±2.73*7.95±2.15*6.40±1.08#5.38±1.24#1.06±0.23 0.53±0.11*1.11±0.33#1.82±0.52#0.85±0.46 G+杆菌 G-杆菌 G+球菌 G-球菌正常对照组未治疗组头孢克洛头孢地尼头孢克肟10 10 10 10 10组别 只数

2.2 头孢菌素对肺炎链球菌感染大鼠肠道菌群数量的影响

将计数所得细菌数量进行对数转换后统计比较，结果显示，与正常对照组相比，在肺炎链球菌感染后未治疗组中肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌数量均明显升高（P<0.05），念珠菌数量虽轻微升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。与正常对照组相比，应用头孢克洛、头孢地尼治疗5 d后，肠球菌数量均显著升高（P<0.01）。与正常对照组相比，应用头孢克肟治疗后肠球菌数量虽轻微升高，但差异无统计学意义（P>0.05）；与感染后未治疗组相比，应用头孢克肟治疗后肠球菌数量明显减少（P<0.05）。与肺炎链球菌感染后未治疗组相比，应用头孢克洛、头孢地尼、头孢克肟治疗5 d后，双歧杆菌和乳酸杆菌数量均显著减少（P<0.05）。与正常对照组和肺炎链球菌感染后未治疗组相比，三种头孢菌素均导致肠道内念珠菌数量显著增多 （P<0.05）。 见表 2。

表2 头孢菌素对4种类型肠道菌群数量的影响（logcfu/g， ±s）

表2 头孢菌素对4种类型肠道菌群数量的影响（logcfu/g， ±s）

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与未治疗组比较，#P<0.05

正常对照组未治疗组头孢克洛头孢地尼头孢克肟10 10 10 10 10 6.79±0.75 8.47±0.67*9.26±0.14**9.68±0.41**7.89±0.53#7.38±0.56 9.35±0.63*6.85±0.95#7.70±1.08#7.86±1.14#6.98±0.46 8.92±0.73*6.85±0.95#7.40±1.08#7.26±1.14#5.46±0.38 5.95±0.74 6.76±0.58*#6.42±0.42*#6.85±0.46*#组别 只数 肠球菌 双歧杆菌 乳酸杆菌 念珠菌

2.3 头孢菌素对肺炎链球菌感染大鼠肠道菌群种类的影响

将各类细菌的检出情况以被检样品总例数中阳性出现的只数表示。在正常对照组各样本中均检出大肠埃希菌和粪肠球菌，未见肺炎克雷伯杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌和屎肠球菌。在肺炎链球菌感染后未治疗组中，10只中有2只新检出肺炎克雷伯杆菌，1只新检出变形杆菌，但肠道内优势菌仍是大肠埃希菌和粪肠球菌，在各样本中均可检出。与感染后未治疗组相比，应用头孢克洛、头孢地尼、头孢克肟治疗5 d后，大肠埃希菌的检出例数分别为8、7、8只，检出率分别降低至80%、70%、80%，可见三种不同头孢菌素类药物对大肠埃希菌均有抑制作用；粪肠球菌检出率也表现出不同程度的降低，其中头孢地尼治疗后粪肠球菌检出率下降最为显著，由100%降低至50%，仅5只检出粪肠球菌。与感染后未治疗组相比，应用头孢克洛、头孢地尼、头孢克肟治疗5 d后，肺炎克雷伯杆菌仍在少数样本（1～2只）中可检出，但变形杆菌的检出率升高，检出例数分别为3、4、2只。与感染后未治疗组相比，应用头孢克洛、头孢地尼、头孢克肟治疗5 d后，铜绿假单胞菌的检出只数分别为4、3、3只，屎肠球菌的检出只数分别为2、3、2只，可见三种不同头孢菌素药物均可导致铜绿假单胞菌和屎肠球菌检出率升高。见表3。

表3 头孢菌素对肠道菌群各类细菌检出情况的影响（只）

3 讨论

抗生素的研发和应用使感染相关性疾病的死亡率明显降低，但随着广谱抗生素的广泛应用，也导致细菌对抗生素的耐药性日益严重，诱导和选择作用引起的细菌耐药问题日益严峻，己成为全球性公共卫生问题[8-10]。肠道菌群是肠道内环境的重要组成部分，通过与宿主之间的相互作用而调控肠道稳态，具有重要的免疫调节、内分泌和代谢等功能。研究表明，肠道菌群失调会扰乱宿主正常的生理平衡[11]，从而引起包括慢性感染、炎症、肿瘤、肥胖、糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病、过敏性疾病等在内的多种疾病[12-13]。研究发现，广谱抗生素的应用将导致肠道内微生态环境失调，在广谱抗生素压力下肠道微生态屏障破坏，不仅使外源性条件致病菌发生肠道定植，还可能诱导肠道原籍条件致病菌引发肠源性感染，因此目前认为广谱抗生素的滥用可能是导致肠道菌群失调、细菌易位及产生细菌耐药菌的重要原因[4-6]。

肺炎链球菌是儿童社区获得性感染的重要病原菌，也是引起儿童呼吸道感染的常见致病菌，主要累及5岁以下儿童[14]。临床上常用口服头孢菌素治疗儿童肺炎链球菌感染。临床研究数据显示，头孢菌素类药物的使用对人体肠道菌群的数量及结构影响明显[15-16]。此外，婴幼儿期是肠道菌群发展的重要时期，过早应用广谱抗生素会干扰婴幼儿正常肠道菌群的定植，破坏早期建立的菌群平衡，更容易导致少数条件致病菌的易位和耐药性的产生，年龄越小影响越明显[17]。研究也发现，在婴儿期使用广谱抗生素会导致过敏性疾病发病率的升高，儿童过敏性疾病的高发与肠道菌群失衡有关，其原因是抗生素应用引起肠道微生物群发生改变，过敏儿童肠道中大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌数量增多而乳酸杆菌和双歧杆菌数量显著减少[18-19]。因此，探讨儿童常用的头孢菌素类药物在儿童常见感染性疾病的治疗过程中对肠道菌群数量和结构的影响对临床合理用药具有重要的指导意义。

在本研究中仍采用了传统的分离检测方法，通过采集模型大鼠粪便和肠道内容物，进行涂片观察和细菌培养计数。涂片法测定粪便中球菌与杆菌的数量是反映肠道菌群平衡的一个基础指标。在健康成年人粪便中，杆菌明显多于球菌，其中G+杆菌占50%～60%，G-杆菌占 40%～50%，G+球菌占 5%～15%，G-球菌占3%～10%。在肺炎链球菌感染大鼠肺炎模型上，连续5 d应用头孢克洛、头孢地尼或头孢克肟，可以对肠道菌群中球菌和杆菌的比例产生不同程度的影响，表明头孢菌素类药物的使用可以影响肠道菌群的数量及结构。人体内正常肠道菌群包括需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌，其中，厌氧菌占绝对优势。肠道内乳酸杆菌、双歧杆菌等专性厌氧菌定植于肠黏膜上皮表面，是机体的生理性益生菌，具有多种微生物拮抗功能，对肠道内兼性厌氧菌和需氧菌等条件致病菌起抑制或杀灭作用，对维持肠道的微生态平衡起重要作用。在多种疾病状态或应用抗生素的情况下，肠道益生菌减少，肠道需氧菌、兼性需氧菌大量增殖，成为优势菌群，导致菌群失调。因肠道菌群所包含的菌种及数量复杂多样，在本研究中选取了肠道常见兼性需氧杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌及真菌作为观察对象。研究表明，在肺炎链球菌感染大鼠肺炎模型上，连续5 d应用头孢克洛、头孢地尼、头孢克肟均可导致肠道双歧杆菌和乳酸杆菌数量显著减少，肠球菌和念珠菌数量增多，继而可能引起菌群失调，使肠道微生态环境失衡[19]。既往研究发现，长期使用头孢曲松可能会导致耐药菌和条件致病菌产生，并取代有益菌成为优势菌群[15，20]。本实验中对肠道兼性需氧杆菌、肠球菌、真菌种类变化的研究结果表明，正常对照组大鼠肠道内容物兼性需氧杆菌中以大肠埃希菌占绝对优势，肠球菌以粪肠球菌占绝对优势，其他条件致病菌因数量低于检测灵敏度而常规平板培养方法不能检出，但应用头孢菌素类药物后，可不同程度出现肺炎克雷伯杆菌、变形杆菌及铜绿假单胞菌等条件致病菌，这可能与乳酸杆菌数量减少导致对其定植抗力减弱有关。此现象在一定程度上也说明，社区获得性感染常见的病原菌铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和变形杆菌等部分可能是肠源性的，肠道菌群对于社区获得性感染的防治具有重要的临床意义。

综上所述，口服头孢菌素类药物也可能破坏肠道微生态环境，引发其他的病理生理过程。在儿科临床应用过程中，应针对不同适应证合理应用抗生素，同时必须严格控制抗生素应用时间的长短，避免导致肠道菌群紊乱而引发过敏及免疫功能下降等问题。在必须使用抗生素时，应尽可能维持微生态平衡，可以考虑适当补充益生菌，预防和减少菌群失调所产生的不良影响。

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