盐霉素聚合物颅内局部给药对大鼠胶质细胞瘤的治疗作用

高峰，梁新政，王元，赵天智，贺世明

(1.总参谋部警卫局卫生保健处,北京 100017;2.解放军第四军医大学附属唐都医院神经外科)



·基础研究·

盐霉素聚合物颅内局部给药对大鼠胶质细胞瘤的治疗作用

高峰1，梁新政1，王元2，赵天智2，贺世明2

(1.总参谋部警卫局卫生保健处,北京 100017;2.解放军第四军医大学附属唐都医院神经外科)

[摘要]目的探讨盐霉素对大鼠9L胶质肉瘤细胞系的体内、外生长和增殖的抑制作用。方法将盐霉素加入体外培养的大鼠9L胶质肉瘤细胞系中检测其对细胞生长、增殖活动的影响。对40只Fisher 344大鼠行颅内9L细胞注射，以制备载瘤大鼠模型。将盐霉素与可生物降解的药物基质聚酸酐类聚合物对羧基苯氧丙烷-癸二酸共聚物(pCPP∶SA)溶解并真空干燥后塑性，制成圆形药物聚合物颗粒。对载瘤大鼠行开颅手术，于瘤腔内植入聚合物颗粒，以观察盐霉素聚合物体内抗肿瘤效果，记录大鼠存活时间，进行进一步生存分析。结果盐霉素对9L细胞具有明显抑制作用，并表现出剂量依赖性特点。盐霉素聚合物颗粒具有良好生物相容性，能够短时间内稳定释放盐霉素进入局部组织。接受盐霉素聚合物治疗的大鼠，其中位生存期较对照组显著增加；采用30%盐霉素比例聚合物能够在延长大鼠生存时间的同时，降低盐霉素的使用剂量。结论盐霉素对9L胶质肉瘤细胞具有强大的抑制杀伤作用，采用盐霉素聚合物肿瘤局部给药的方式具有重大临床潜在研究和应用价值。

[关键词]神经胶质瘤;抗生素类，抗肿瘤；细胞生长过程;细胞增殖；模型,动物

脑恶性胶质瘤是最常见的大脑原发肿瘤之一，其生长迅速、恶性程度高、侵袭能力强、患者预后极差[1]。近年来对恶性胶质瘤的研究治疗取得了一系列重要发展，随着手术技术的改进和提高、放疗和化疗药物的不断改良，患者中位生存期也从9个月延长为20个月[2]。然而由于颅内恶性胶质瘤位于中枢神经系统内部，血脑屏障和神经系统毒性等因素限制了许多新型化疗药物的临床使用。

作为化疗药物全身给药的有效补充，颅内局部给药方式通过化疗药物和聚合物分子相结合的方式，对肿瘤局部进行药物控制释放，从而发挥药物的抗肿瘤效果。这种局部给药的方式既能克服全身用药伴随的局部药物浓度不足的问题，又能提高药物作用时间，避免药物浓度波动[3]。

盐霉素是一种从链霉菌中分离得到的羧基聚醚类离子载体药物，以往盐霉素主要应用于家禽的抗球虫病治疗和反刍动物的生长促进剂[4]。2009年，Gupta等[5]首次发现了盐霉素对乳腺癌肿瘤干细胞的杀伤作用比常用化疗药物紫杉醇强约100倍以上。随后研究也表明了盐霉素对体外培养的胃肠道间质瘤细胞、人类肺腺癌细胞、鳞状细胞癌等诸多肿瘤细胞系具有抑制细胞生长增殖的作用[6]。尽管目前对盐霉素的抗肿瘤机制研究还不充分，但已有证据表明盐霉素能够抑制血脑屏障上表达的p-糖蛋白(p-GP)，进而抑制肿瘤的多药耐药机制，最终引导细胞凋亡[7-8]。

本研究采用盐霉素和聚合物分子结合制作药物聚合物颗粒，研究盐霉素对体外培养的大鼠胶质肉瘤细胞9L细胞系和体内9L胶质肉瘤大鼠的肿瘤抑制作用，为盐霉素进一步应用于胶质瘤的治疗提供新的方法及思路。

1材料和方法

1.1材料Fisher 344大鼠，体质量150~200g(第四军医大学实验动物中心提供)，所有动物均严格按照SPF标准进行管理和实验；盐霉素(Sigma公司)；改良的Eagle培养基(DMEM)，胰蛋白酶，10%胎牛血清、青霉素、链霉素、1% L-谷氨酰胺(Gibico公司)；CCK-8试剂盒(Dojindo公司)；癸二酸(sebacic acid,SA)、1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷[1,3-bis(p-carboxyphenoxy) propane,CPP]、甲醇、二氯甲烷溶液(Sigma公司)。

1.2细胞系9L胶质肉瘤细胞系由第四军医大学唐都医院全军功能神经外科研究所提供。用含有10% 胎牛血清、80.5 u/mL青霉素、80.5 μg/mL链霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞，在5%的CO2孵育箱中37 ℃恒温、饱和湿度培养，2~3 d传代。

1.3盐霉素对9L细胞生长的抑制作用为研究盐霉素对9L细胞生长的剂量反应关系曲线，将处于对数生长期的9L细胞种植于96孔板中(10 000细胞/孔，100 μL/孔)，盐霉素浓度梯度设置为0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0、15.0 μmol/L，同时设有DMSO对照及无细胞调零孔，每组5个复孔。在5% CO2、饱和湿度、37 ℃孵箱中孵育24 h后，加入CCK-8试剂再孵育2 h，将细胞培养板置于全自动酶标仪上，测量波长为490 nm下各孔的吸光度值。根据实验数据计算作图，采用绘制盐霉素对9L细胞的剂量反应曲线。

1.4盐霉素聚合物的制备将CPP和SA作为生物可降解聚合物的基质材料(20∶80)。将甲醇、盐霉素、pCPP∶SA(20∶80)溶解于二氯甲烷中，真空干燥2~3 h后，形成固体复合物粉末，至于-20 ℃保存。采用磨具将该复合物粉末挤压职称直径3 mm、厚度1 mm、重量约3 mg的圆形盐霉素聚合物。盐霉素质量比例分别为15%、30%和50%(w/w)。同时制作无盐霉素的空白聚合物作为对照。

1.5药物释放检测试验为了解盐霉素聚合物的药物释放情况，将盐霉素聚合物样品至于37 ℃的1 mL PBS溶液中，并于1、3、6、9、24及48 h分别进行药物浓度检测。药物释放浓度通过紫外光谱法分析。药霉素浓度释放曲线采用溶液浓度±标准误表示。

1.6建立大鼠9L颅内肿瘤模型腹腔注射氯胺酮(25 mg/mL)溶液麻醉大鼠(3 mL/kg)，沿大鼠颅顶中线做切口，将左侧皮肤及腱膜组织拉向外侧，在显微镜下于左侧顶骨处钻一个3 mm孔，位置为冠状缝后2～3 mm，矢状缝外侧3～4 mm处。避免损伤硬膜组织。随后将大鼠固定于立体定向仪，将1×103的9L肿瘤细胞注入大鼠脑实质组织。确切止血后，缝合伤口并消毒。

1.7体内毒性实验为了解盐霉素聚合物样品对大鼠是否存在毒性作用，选取正常健康大鼠15只进行体内毒性实验。大鼠随机分为3组，每组5只。所有大鼠均开颅进行置入药霉素聚合物手术。将含有15%、30%和50%(w/w)的盐霉素聚合物样品分别植入大鼠颅内。大鼠麻醉后颅顶部备皮，与上述肿瘤模型类似，在显微镜下于左侧将大鼠于显微镜下左侧顶骨处钻孔。通过骨窗孔，小心打开硬膜、脑实质，并将盐霉素复合物置于硬膜下1mm处的脑实质中。严密止血后，缝合伤口并消毒。每天连续观察大鼠是否存在运动障碍、神经系统毒性等其他体征，评估其局部及全身性药物毒性反应。连续观察40 d后处死大鼠，收集大鼠脏器进行病理学检查。

1.8盐霉素聚合物的体内抗肿瘤实验及生存分析体内实验安全性基础之上，选取载瘤大鼠进行生存分析研究。40只大鼠进行9L细胞颅内注射后第5天，将载瘤大鼠分为5组，分别为9L肿瘤假手术组(对照)、pCPP:SA聚合物空载体组、pCPP:SA+15%盐霉素组、pCPP:SA+30%盐霉素组、pCPP:SA+50%盐霉素组，每组8只大鼠。再次打开原手术切口，无菌条件下将盐霉素复合物放置于肿瘤瘤腔组织中。止血后缝合伤口并消毒。每天连续观察动物是否出现全身性及神经系统毒性反应，并记录大鼠死亡时间。第70天时终止实验，处死所有大鼠。收集并固定大鼠脑组织，行相关病理学检查。

1.9统计学处理采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理，采用单因素方差分析(ANOVA)统计各组间差异的显著性。剂量效应曲线标准化后进行曲线拟合。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1盐霉素对9L细胞的抑制生长作用盐霉素在0.1~15 μmol/L之间对9L细胞具有显著的抑制作用，并表现出剂量依赖特点。0.5 μmol/L时即表现出一定抑制效果，在1.0、3.0、5.0、7.0和10.0 μmol/L时，其细胞活性分别为(80.36±25.21)%、(62.1±26.67)%、(44.14±21.38)%、(13.85±6.18)%和(1.37±0.912)%(图1)。根据实验结果计算得其IC50为3.508 μmol/L。

2.2盐霉素聚合物释放实验将盐霉素以不同比例与pCPP:SA混合后得到15%、30%、50%(w/w)的聚合物颗粒。药物浓度释放曲线如图2所示。聚合物药物释放曲线表明，约60%左右药物在前10小时内聚合物颗粒中快速释放，其后释放逐渐减缓。48 h后，pCPP:SA+15%盐霉素组释放量约为(56±4.7)%，pCPP:SA+30%盐霉素组释放量为(68±10.1)%，pCPP:SA+50%盐霉素组释放量为(59±8.3)%。该实验表明盐霉素聚合物颗粒能够在短时间内释放出主要盐霉素物质，同时不断持续释放盐霉素至组织液中。

2.3盐霉素聚合物颗粒在体毒性研究所有颅内置入盐霉素-聚合物颗粒的3组大鼠均未表现出神经系统或全身性的毒理性损伤，无体质量减轻等其他不良反应。考虑到口服盐霉素对大鼠的LD50值为50.3 mg/kg，50%盐霉素聚合物颗粒约含有盐霉素1.4 mg，可见盐霉素聚合物颅内置入对组织无毒性作用。同时聚合物基质pCPP:SA能够在组织中代谢降解，具有良好的生物相容性。

2.4盐霉素聚合物体内抗肿瘤效果及大鼠生存分析共计40只9L载瘤大鼠在肿瘤种植手术后第5天进行了聚合物颗粒植入手术，持续观察并进行生存分析。空白聚合物载体组中位生存时间与肿瘤对照组无显著差别(对照组中位生存期为13 d，pCPP:SA空聚合物载体组为13.5 d)。置入盐霉素-聚合物颗粒的3组大鼠其生存时间较对照组显著增加：pCPP∶SA+15%盐霉素组中位生存期为19 d，与对照组相比,P<0.01；pCPP:SA+30%盐霉素组中位生存期为24 d，与对照组相比,P=0.0023；pCPP∶SA+50%盐霉素组大鼠中位生存期为25.5 d，与对照组相比,P=0.0008)。第60天实验结束时，pCPP∶SA+15%盐霉素组有25%大鼠存活，pCPP∶SA+30%盐霉素组中仍有25%大鼠存活，pCPP∶SA+50%盐霉素组中仍有37.5%大鼠存活。虽然最终生存率存在不同，但pCPP∶SA+30%盐霉素组大鼠和pCPP∶SA+50%盐霉素组大鼠的生存时间差异无统计学意义(P=0.6228)。采用30%盐霉素能够在减少盐霉素使用剂量的同时，延长载瘤大鼠生存时间(图3)。

组织病理学检查表明，长时间生存大鼠其脑部未见显著肿瘤组织。

3讨论

有研究报道，盐霉素能够显著降低GL261-NS和GS261-AC细胞系的细胞活性，抑制细胞增殖，并通过上调caspase-3活性进而诱导细胞凋亡[9]。在本研究中，我们的体外培养实验也验证了盐霉素能够抑9L胶质肉瘤细胞的生长和增殖，并表现出剂量依赖性。

虽然已有不少研究报道指明盐霉素具有强效的体外抗肿瘤效果，但盐霉素全身给药时可能出现严重副作用，如体质量减轻、发育迟滞、生殖系统损伤等，具有一定心毒性和神经系统毒性；同时由于血脑屏障中渗透性糖蛋白(p-Gp)的转运作用对盐霉素的药物分布产生了一定影响[8]。因此，采用传统的盐霉素全身性给药的方式，一方面为避免出现严重副作用而难以提高给药剂量，进而影响血药浓度，另一方面颅内肿瘤局部组织也难以达到有效的药物治疗浓度。

本研究中采用可生物降解的聚酸酐类聚合物pCPP∶SA作为药物基质，具有很好的生物相容性和可降解性。其SA单体最终分解为CO2，CPP则主要通过肾脏和粪便途径排出体外，无组织内累积效应[10]。美国FDA批准允许临床使用胶质瘤缓释植入剂Gliadel®Wafer即是卡莫司汀和聚酸酐分子的复合物[11]。我们的载瘤大鼠在体实验表明，将该聚合物与盐霉素结合形成聚合物颗粒后，置入大鼠胶质瘤瘤腔中，盐霉素聚合物治疗组大鼠中位生存期显著增加，证明了盐霉素对大鼠体内胶质瘤细胞的生长增殖具有抑制作用。同时由于采用瘤腔局部给药的方式，在提高肿瘤部位药物有效治疗浓度的同时，避免了全身性药物副作用的产生。

同时，不同浓度盐霉素聚合物颗粒与大鼠生存时间曲线也表现出浓度依赖关系。随着盐霉素浓度的提高，大鼠生存时间也不断增加。然而通过分析30%盐霉素和50%盐霉素治疗组的差异，盐霉素药物毒性反应也随着浓度的上升和不断增加。因此在提高生存期的同时，不断减少其毒副作用，是下一步探寻盐霉素治疗策略的重要内容。

在本研究中，我们采用可生物降解的聚酸酐分子与盐霉素结合形成聚合物颗粒，行大鼠颅内肿瘤局部植入，证实了盐霉素对胶质肉瘤细胞具有强大的抑制杀伤作用。而采用聚合物盐霉素局部给药的方式，或许能够在提高肿瘤部位局部血药浓度的同时，减轻全身性药物副作用，防止胶质瘤的复发，延长肿瘤患者生存期。

(本文图1~3见插图3-2)

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A treatment study of 9L gliosarcoma in rats by the local delivery of salinomycinpolymer

GaoFeng*,LiangXinzheng,WangYuan,ZhaoTianzhi,HeShiming

(*HealthDivisionofGuardBureau,GeneralStaffDepartmentofChinesePLA,Beijing100017)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the inhibition effect of salinomycin polymers on the growth and proliferation of 9L gliosarcoma cells in vitro and in vivo.MethodsSalinomycin was applied to the cultured 9L cell lines,and the growth and proliferation ability were tested 40 Fisher 344 rats were received intracranial injection of 9L cells.Polyanhydride polymers were composed with 1,3-bis(p-carboxyphenoxy) propane (CPP) and sebacic acid (pCPP∶SA),and contained salinomycin.The polymers were manufactured by mix-melt method and shaped into round pills.The polymer complexes were implanted into the tumor cavitiesin vivo on the 5th day after tumor cell injection.The rat survival time and histological characteristics were examined to compare the difference treatment condition of salinomycin polymers.ResultsSalinomycin could inhibit the growth and proliferation of 9L cells and showed a dose-dependent characteristic.The salinomycin polymers were biodegradable and could release salinomycin into the adjacent tissue in a short time.Compared with the control group,the median survival time was increased significantly in salinomycin polymers group.The 30% salinomycin polymer could increased the median survival time of rats,as well as decreased the dosage of salinomycin.ConclusionSalinomycin is an effective antitumor drug for the 9L gilosarcoma treatment.Local delivery of salinomycin polymer may be a promising method for the current clinical tumor treatment.

[Key words]Glioma;Antibiotics,antineoplastic;Cell growth processes;Cell proliferation；Models,animal

(收稿日期：2015-03-18)

Corresponding author:He Shiming，Email:hshimin@fmmu.edu.cn

中图分类号：R739.41；R979.14

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.022

通信作者：贺世明，博士，主任医师，Email:hshimin@fmmu.edu.cn

作者简介：高峰，主任医师，Email：luckygf2004@163.com