基质细胞衍生因子-1及Wnt信号对肌成纤维细胞生物特性的影响

邵帅，蔡文玮，盛净，陆平

(上海交通大学医学院附属第九人民医院老年病科，上海 200011)

·基础研究·

基质细胞衍生因子-1及Wnt信号对肌成纤维细胞生物特性的影响

邵帅，蔡文玮，盛净，陆平

(上海交通大学医学院附属第九人民医院老年病科，上海 200011)

[摘要]目的探讨基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及Wnt信号通路对诱导生成的肌成纤维细胞的生物学特性的影响。方法首先体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为肌成纤维细胞(MF)，然后改变SDF-1及(或)Wnt信号，通过划痕实验观察MF迁移能力的变化，qRT-PCr检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的改变。结果转化生长因子(TGF-β)及高浓度血清等条件的诱导，可使BMSCs分化为MF。阻断SDF-1或Wnt信号时，会显著抑制MF的迁移及Col-Ⅰ的分泌，阻断Wnt信号可明显抑制BMSCs向MF的分化。结论SDF-1与Wnt信号参与调节MF的迁移及ColⅠ分泌，Wnt信号对BMSCs向MF分化具有重要作用。

[关键词]肌成纤维细胞；趋化因子CXCL12;Wnt信号通路;胶原Ⅰ型

The influence of sdf-1 and wnt signal pathway on the biological features of myofibroblastShaoShuai,CaiWenwei,ShengJing,LuPing(DepartmentofGeriatrics,ShanghaiNinthPeople'sHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200011,China)Correspondingauthor:CaiWenwei,Email:wodafeidebaobei@126.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the impact of SDF-1 and wnt signal pathway on the biological characteristics of Myofibroblast .MethodsFirstly the BMSCs were induced to differentiate into MF,then after the change of SDF-1 and (or) Wnt signal pathway ,the MF's type Ⅰ collagen(ColⅠ) and α-smooth muscle actin(α-SMA) mRNA expression were detected and the migration ability of MF was evaluated by scratch experiments.Results (1) BMSCs could be induced to differentiation into MF in the condition of culture medium including transforming growth factor-β(TGF-β) and high concentration of serum in vitro;(2)When SDF-1/CXCR4 or Wnt signal pathway were blocked ,the migration ability of MF and secretion of ColⅠwas inhibited significantly;(3)The BMSCs differentiation into MF can be inhibited by blocking Wnt signal pathway.ConclusionSDF-1 and Wnt signal pathway play an important role in the regulation of MF migrationand ColⅠ secretion ,and Wnt signal pathway involves in the regulation of BMSCs differentiation into MF.

[Key words] Myofibroblasts;Chemokine CXCL12;Wnt signaling pathway;Collagen type I

肌成纤维细胞(MF)在纤维化的过程中起着核心的作用[1-2]，它既有成纤维细胞的特性，可分泌Ⅰ型胶原(ColⅠ)，又有类似平滑肌细胞功能，可分泌α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是体内MF的重要来源之一。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及Wnt (wingless related proteins )信号通路在组织损伤的纤维化修复及纤维化病变中起着重要作用[3-4]。通过从SDF-1/CXCR4与wnt信号联合研究，将会发现它们对MF细胞迁移、ColⅠ及α-SMA分泌等细胞特性的影响，为临床治疗、预防纤维化提供可能的治疗靶点。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物3周龄SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2004-2005，使用许可证号：SYXK(沪)2007-0007。

1.1.2试剂 L-DMEM、H-DMEM(Hyclone公司，美国)，胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，多克隆抗体α-SMA(abcam公司，美国)，单克隆抗体CD29FITC、CD45FITC、CD90FITC(bdbiosciences公司，美国)，转化生长因子β1(TGF-β1)(Peprotech公司，美国)，人重组SDF-1因子(Peprotech公司，美国)，AMD3100(Sigma公司，美国)，ICG-001(Selleck公司，美国)。

1.1.3仪器 倒置相差显微镜(Olympus IMT-2，日本)，CO2恒温孵箱(ThermoForma公司，美国)，荧光定量PCR仪(美国STRATAGNNE)。

1.2方法

1.2.1大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定3周龄SD大鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡30 min。无菌条件下分离股骨和胫骨，去除骨骺端，用L-DMEM反复冲洗骨髓腔，经200目滤网过滤后，1500 r/min 37 ℃离心5 min，使用含10%胎牛血清(FBS)、100 u/mL青霉素、链霉素的L-DMEM重悬后，种植于100 mm培养皿中，在37℃、5%CO2环境中培养，密度达95%时，用2.5 g/L的胰酶消化，按1∶2传代。取P3代细胞用于后续试验。

对培养的BMSCs采用流式细胞术鉴定其纯度，取P3代BMSCs，0.25%胰酶消化、终止后，细胞计数，每个指标所用细胞量5×105个，分别加入单克隆抗体CD29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC，室温避光孵育45 min，含2%血清的PBS作为工作液漂洗2次，500 μL工作液重悬细胞，流式细胞仪上机检测。

1.2.2骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞的诱导及细胞免疫荧光鉴定[5]P3代BMSCs经胰酶消化、终止后，按每孔5×104个细胞的密度种植于6孔板上，分别给予不同的处理，诱导组加入含20%FBS、5 μg/LTGF-β1因子的H-DMEM，对照组加入常规含10%FBS的L-DMEM，连续诱导2周，分别用细胞免疫荧光及qRT-PCR方法鉴定后，使用诱导成功的骨髓源性的肌成纤维细胞(B-MF)进行后续实验。

如细胞量过多，可先将其消化，并重新种植于60 mm培养皿中，生长1 d后，PBS冲洗5 min，行2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗5 min，行3次，triton破膜15 min，抗体封闭液60 min，加入兔抗大鼠α-SMA抗体(1∶100)，4℃过夜，PBS冲洗5 min，行3次，加抗兔荧光二抗，37℃孵育1 h，PBS冲洗，DAPI染核45 s，PBS清洗，荧光倒置显微镜观察、拍照。

1.2.3细胞迁移实验B-MF以每盘0.5×106个细胞种植在35 mm的培养皿上，达到90%融合度时进行划痕实验，用200 μL的无菌枪头在培养皿中部划出一条直线，即用显微镜拍照(0 h)，然后将细胞培养在含1%FBS的DMEM，分为6组，分别给予如下处理：①空白对照组，加入PBS；②SDF-1因子100 μg/L；③SDF-1 100 μg/L，SDF-1受体CXCR4抑制剂(AMD3100)500 μg/L；④SDF-1 100 μg/L，wnt信号阻滞剂(ICG-001)500 μg/L；⑤SDF-1 100 μg/L，AMD3100 500 μg/L，ICG-001 500 μg/L；⑥AMD3100 500 μg/L，ICG-001 500 μg/L。分别于12 h、24 h、36 h、48 h通过显微镜观察并拍照细胞迁移和划痕愈合情况。

1.2.4 检测SDF-1/CXCR4、Wnt信号对BMSCs向B-MF分化的影响将已诱导成功的BMSCs分为6组，除基础培养条件为20%FBS+5 μgTGF-β+H-DMEM，分组及各组处理同细胞迁移实验。连续处理3 d后，收集细胞，行PCR检测各组ColⅠ及α-SMA的mRNA的表达量。

1.2.5实时定量RT-PCR(qRT-PCR)按照RNA提取试剂盒说明书提取B-MF总RNA，紫外分光检测所提取RNA的纯度和浓度，按照逆转录试剂盒说明书以Oligo为引物反转录RNA(2 μg)为cDNA(20 μL体系)。采取定量PCR技术，检测各组目的基因mRNA表达的相对量。ColⅠ及α-SMA基因序列如下，Col Ⅰ：F 5′-GGAGAGAGTGCCAACTCCAG-3′，R 5′-GTGCTTTGGAAAATGGTGCT-3′(182bp)；α-SMA：F 5′-CCGAGATCTCACCGACTACC-3′，R 5′-TCCAGAGCGACATAGCACAG-3′(120bp)。

1.3统计学处理运用SPSS17.0软件对所得数据进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1BMSCs的培养及鉴定结果显示，培养的第3代大鼠BMSCs高表达CD29和CD90阳性率分别达84.3%和 94.2%，为间充质干细胞的特征性抗原，而造血干细胞表面抗原CD45阳性率为6.2%，BMSCs纯度满足实验需要。

2.2BMSCs向B-MF的诱导及鉴定免疫细胞荧光染色结果显示：与BMSCs组相比，TGF-β诱导组α-SMA的阳性率达到95%，差异有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR检测诱导组和BMSCs组的ColⅠ及α-SMA的mRNA表达情况，可见诱导组的ColⅠ及α-SMA 的mRNA表达明显高于BMSCs组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明BMSCs向B-MF诱导成功，可用于后续实验(图1，2)。

2.3SDF-1/CXCR4轴对B-MF细胞迁移的影响划痕实验48h后观察结果显示，与对照组相比，SDF-1处理组明显促进了B-MF的迁移(P<0.05)，而在同时使用AMD3100阻断SDF-1/CXCR4处理组，细胞迁移作用受到抑制(P<0.05)，当同时使用ICG-001阻断Wnt信号时，B-MF的迁移作用也会受到一定的抑制作用，但ICG-001对细胞迁移的抑制明显弱于AMD3100(图3)。

2.4SDF-1/CXCR4及Wnt信号对BMSCs向B-MF细胞分化及胶原分泌的影响qRT-PCR检测ColⅠmRNA，与对照组相比，加入AMD3100或ICG-001处理组的ColⅠ相对mRNA含量显著降低(P<0.05)，而在联合使用AMD3100及ICG-001处理时，与两者单独处理相比，ColⅠmRNA含量有显著降低(P<0.05)。检测α-SMA结果显示，与对照组相比，加入ICG-001的各组的α-SMA mRNA含量显著降低(P<0.05)，AMD3100则没有这样的效果(图4)。

3讨论

MF在组织纤维化的过程中起着核心的作用，组织中MF有两大来源，一是间质中成纤维细胞活化，继而成为MF，二是BMSCs诱导分化成MF，并在趋化因子的作用迁移定植于组织，合成并分泌ColⅠ[6]，从而造成相应器官组织的纤维化，破坏器官组织结构的同时，严重影响功能的发挥。因此，若能采取措施抑制BMSCs向MF分化、抑制BMSCs分化的MF(B-MF)进入组织、抑制B-MF分泌ColⅠ，则可能预防减缓或治疗纤维化的进程，改善脏器功能。

SDF-1是重要的趋化因子，在干细胞招募及迁移过程中起着重要作用，SDF-1的生物学作用主要通过受体CXCR4起作用。研究发现心肌缺血与心肌梗死时，缺氧可上调SDF-1表达，促进BMSCs进入缺血区域，促进新生血管的形成，改善心脏功能[7]；研究还表明，在辐射诱导的小鼠肺纤维化模型中，SDF-1/CXCR4的表达增高明显，而在使用CXCR4的抑制剂后，辐射造成的肺部纤维化程度明显改善[8]；CXCR4也可以介导BMSCs到大鼠肾脏损伤部位，参与修复[9]。因此，认为SDF-1介导了MSCs的纤维化修复，但其纤维化效果对于组织功能的减退也有影响。

Wnt信号是细胞增殖、分化的强效调节因子[10]。有研究表明Wnt信号通路广泛参与组织纤维化过程，但其具体调节机制尚不明确，De Langhe[11]对Wnt信号的抑制分子分泌型卷曲相关蛋白-1(SFRP1)研究发现，在体外它可以显著抑制TGF-β诱导的纤维母细胞ColⅠmRNA的表达，但体内情况下，SFRP1对组织的纤维化似乎没有影响，而Matsuyama[12]研究发现,SFRP1基因敲出的小鼠，肾组织纤维化程度显著高于野生型小鼠，研究结果尚存争议，因此Wnt信号对组织器官的纤维化的影响的具体机制有待进一步深入研究。

在本实验中，通过联合或分别阻断SDF-1及Wnt信号通路，观察B-MF迁移能力的改变及ColⅠ、α-SMA分泌量的变化。结果表明SDF-1可以增强B-MF的迁移能力，这一作用可以被CXCR4抑制剂AMD3100阻断，Wnt信号的抑制剂ICG-001可以部分抑制B-MF的迁移作用，但抑制效应明显弱于AMD3100的抑制效应，AMD3100与ICG-001联合使用，并没有进一步减弱细胞的迁移能力，因此我们推断Wnt信号对B-MF迁移的调节受SDF-1/CXCR4的调控；对诱导成功的BMSCs细胞，分别给予不同的处理后，检测ColⅠ的mRNA发现，ICG-001对B-MF ColⅠ的分泌有明显的抑制效应，而AMD3100也对ColⅠ分泌有部分抑制作用，两者联合使用可以进一步降低ColⅠmRNA水平。因此，我们可以认为SDF-1/CXCR4和Wnt信号对MF细胞分泌ColⅠ具有协同的抑制作用。ICG-001及AMD3100对BMSCs向B-MF分化过程的影响,检测结果表明，α-SMA在ICG-001处理的各组降低较为显著，而AMD3100并没有这样的作用，因此推测Wnt信号参与调节BMSCs向B-MF的分化。

综上所述，SDF-1/CXCR4与 Wnt信号共同参与调节B-MF的迁移及Col-Ⅰ的分泌，同时Wnt信号广泛参与BMSCs向MF的分化，两信号对B-MF生物学特性的影响存在协同作用，共同影响B-MF从而参与组织纤维化，其具体明确的机制尚需进一步深入研究，相信这些研究将为纤维化预防、治疗提供理论支持和可能。

(本文图1~4见插图4-4)

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(收稿日期:2015-01-10)

通信作者：蔡文玮，博士，副主任医师，硕士生导师，Email:wodafeidebaobei@126.com

作者简介：邵帅，硕士在读，Email: shaomao8822@163.com

中图分类号：R38

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.021